李亞茹 ，王銀磊 ，趙麗萍， 楊瑪麗， 姜 靜 ，趙統(tǒng)敏* ，余文貴**

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

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不同抗病基因型番茄對番茄黃化曲葉病毒的抗病性鑒定

李亞茹1,2，王銀磊1*，趙麗萍1， 楊瑪麗1， 姜 靜1,2，趙統(tǒng)敏1**，余文貴1,2**

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

對抗病基因進(jìn)行抗性評價是番茄抗病育種的重要環(huán)節(jié)。選用6 種抗病番茄材料和2種感病番茄材料，利用攜帶番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus ，TYLCV)的煙粉虱對所選番茄材料幼苗接種病毒，統(tǒng)計分析各材料的病情指數(shù)、病株率和帶毒率，鑒定不同基因型番茄材料的抗性水平。結(jié)果表明，所有接種材料中均可以檢測到攜帶TYLCV，其中含有Ty-2和Ty-5基因的番茄材料對江蘇地區(qū)TYLCV病毒種類抗性較好，Ty-3次之，Ty-1 抗性相對較弱，Ty-3a在櫻桃番茄中抗性強(qiáng)于大果型番茄。本試驗為抗病育種過程中對抗病基因的選擇提供了一定的參考依據(jù)。

番茄；番茄黃化曲葉病毒；抗性基因；抗性鑒定；抗病材料

番茄雙生病毒是威脅世界各地番茄(Solanumlycopersicum)生產(chǎn)的重要病毒，2011年被列入世界十大重要植物病毒之一[1]。番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)于 19 世紀(jì)20 年代在以色列約旦河一帶首次被發(fā)現(xiàn)，是所有侵染番茄的雙生病毒中最早被發(fā)現(xiàn)的，也是危害最為嚴(yán)重的[2-3]，能夠引起番茄黃化曲葉病(Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)。該病最初只在地中海一代零星發(fā)生，隨著全球氣候的變化、農(nóng)業(yè)耕作制度的改變、國際間貿(mào)易活動的迅速加強(qiáng)和煙粉虱介體在世界各地空前擴(kuò)展，TYLCD 在世界范圍內(nèi)大面積爆發(fā)流行，在番茄生產(chǎn)上引起嚴(yán)重危害[4]。中東、非洲、歐洲、美洲、澳大利亞、日本、印度等國家和地區(qū)均發(fā)生過嚴(yán)重災(zāi)害。在 20 世紀(jì) 90 年代，我國的廣東、廣西、臺灣和云南等熱帶和亞熱帶地區(qū)曾有TYLCD零星發(fā)生，但是從 2005 年開始，該病自南向北迅速蔓延，在廣東、廣西、浙江、上海、江蘇、河南、山東、河北等地大面積暴發(fā)，發(fā)病地塊減產(chǎn)嚴(yán)重，個別發(fā)病嚴(yán)重的地塊甚至絕收，給番茄生產(chǎn)造成了極其嚴(yán)重的損失[5-12]。

番茄黃化曲葉病毒病具有發(fā)病率高、危害大、防治難、傳播效率高等特點(diǎn)[13]。通過化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治的方法只能在一定程度上減輕該病的危害，不能從根本上解決問題，而培育番茄抗病品種是較為經(jīng)濟(jì)、有效、綠色、持久的防治方法[14-15]。

早期的栽培番茄品種中沒有抗番茄黃化曲葉病的基因，而在野生番茄中蘊(yùn)含著豐富的抗病基因[16-17]。通過野生番茄與栽培番茄雜交，可以把抗病基因由野生番茄轉(zhuǎn)入到栽培番茄中去，從而使栽培番茄產(chǎn)生抗病性。目前已經(jīng)從野生番茄材料中找到 6 個抗 TYLCV 的基因，這 6 個基因在很多方面具有不同的特性[18]。Ty-1來自智利番茄材料(S.chilense) LA1969，該基因被定位于番茄第 6 號染色體近著絲粒區(qū)域[19]。之后，Ji 等在智利番茄 LA2779 和 LA1932中定位了另一個抗TYLCV的主效基因Ty-3，這是一個主效基因, 位于番茄第 6 號染色體的長臂端，該基因不僅抗 TYLCV，而且對多種雙生病毒都有抗性[20]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Ty-1 和Ty-3 為等位基因，Bai將Ty-1 定位在標(biāo)記 HBa0161K22 和 WU_M31 大約 70 kb的范圍內(nèi)，Ty-3 定位在 71 kb 的區(qū)域包含Ty-1[21]。Ty-2 發(fā)現(xiàn)于多毛番茄(S.habrochaites) B6013，為完全顯性遺傳的抗性基因，該基因位于番茄第 11 號染色體長臂端，在標(biāo)記 C2_At1g0796 和 cLEN-11-F24 之間，約 4.5 cM 間隔范圍內(nèi)[22]。Ty-4是另一個新的抗性基因，來源于智利番茄 LA1932，位于第 3 號染色體長臂端標(biāo)記 C2_At4g17300(81.0 cM)和C2_At5g60160(83.3cM)之間，Ty-4的加顯效應(yīng)為 15.7 %，與Ty-3 相比并不是一個主效基因[23]。Anbinder 等在 TY172 中定位了抗TYLCV 的一個主效基因Ty-5，Ty-5 是秘魯番茄(S.peruvianum)材料 TY172 抗黃化曲葉病的主效基因，該基因位于番茄第 4 號染色體，與 CAPS 標(biāo)記SlNAC1 連鎖[24]。Hutton 等利用SlNAC1 標(biāo)記從番茄材料 Ty-king 中得到一個在Ty-5 附近隱性遺傳的抗性基因ty-5[25]。通過對含有Ty-5基因材料AVTO1227進(jìn)行引進(jìn)和抗性評價，確定該基因?qū)YLCV具有較高的抗性[26]。Ty-6是最近發(fā)現(xiàn)的新的抗性基因，含有Ty-6抗性基因的純合抗病材料對TYLCV表現(xiàn)出很高的抗性[27]。

本試驗選用分別含Ty-1 、Ty-2、Ty-1+Ty-3、Ty-1+Ty-3a和Ty-5的抗病番茄材料，通過煙粉虱接種來檢測材料的抗病性，旨在比較幾個抗性基因的抗病性，為抗番茄黃化曲葉病毒育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

含有TYLCV抗性基因的番茄材料TY52-0(Ty-1/Ty-1)、CLN2777A-0(Ty-2 /Ty-2)、99S-C-39-20-11-24-17-0-0 (Ty-1/Ty-1和Ty-3/Ty-3)、AVTO1227(Ty-5/Ty-5)、1106F2-1-2-0-7(櫻桃番茄)(Ty-1/Ty-1和Ty-3a/Ty-3a)、10-A-GY-13-12-1-1-0(Ty-1/Ty-1和Ty-3a/Ty-3a)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄組提供，以不含有抗性基因的番茄品種GT9320-0(櫻桃番茄)和moneymaker作為感病對照。

1.2 試劑

2×TaqMaster Mix DNA聚合酶 購于Vazyme公司；100 bp DNA Ladder(Dye Plus) 購于TaKaRa公司 ；DNA試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 番茄種植與接種 試驗地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植基地。所有試驗材料采取穴盤育苗的方式播種于設(shè)有 30～40 目防蟲網(wǎng)的日光溫室，每個品種播種60株，其中30株用于接種，30株作為陰性對照。待幼苗生長至 3～4 葉期采用煙粉虱接種方法接種TYLCV，接種1周后用吡蟲啉殺死接種植株上的煙粉虱，將苗盆放到?jīng)]有煙粉虱的溫室內(nèi)繼續(xù)生長，定時觀察和檢測番茄發(fā)病情況。

1.3.2 番茄抗性基因的檢測 待番茄長出真葉，對每一個番茄材料混合取樣，用試劑盒提取DNA，用表1中引物檢測番茄抗性基因，根據(jù)擴(kuò)增片段大小判斷番茄材料所帶抗性基因以及番茄材料是否純合。其中根據(jù)slNACI標(biāo)記測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酶切位點(diǎn)很多，對該標(biāo)記進(jìn)行了優(yōu)化，將新的標(biāo)記命名為NACI-new，退火溫度為53 ℃。

1.3.3 番茄材料病情調(diào)查與分析 每周調(diào)查番茄發(fā)病情況，每周統(tǒng)計感病對照病株率。根據(jù)42 d發(fā)病情況對所有植株病情嚴(yán)重指數(shù)(disease severity index，DSI) 進(jìn)行統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果按照發(fā)病嚴(yán)重程度分為 0 ～4 級:0級，無任何感病癥狀；1 級，頂端葉片輕微黃化；2 級，頂端葉片變黃并發(fā)生輕微卷曲； 3 級，大面積葉片黃化、卷曲,皺縮,但植株未停止生長；4 級，植株嚴(yán)重矮縮、黃化、皺縮,并停止生長[31]，為了更加精確，將介于 2 種分級中間的表型用0.5、1.5、2.5和3.5進(jìn)行表示。病情指數(shù) =∑ (各級病株數(shù)×該病級值) /(調(diào)查總株數(shù) ×最高病級數(shù)) ×100。通過計算和比較不同材料的病情指數(shù)，確定抗病和感病特性。病株率=發(fā)病的植株數(shù)/調(diào)查總植株數(shù)×100 %。

1.3.4 PCR檢測帶毒率 在接種42 d后對各品種進(jìn)行 PCR 檢測(表1)，以此判斷該品種對 TYLCV 的易感程度。引物用TYF：5’-ACGGATTTCGTTGTATGTTA-3’，TYR:5’-ACCTCTTACCCACTCTGTGA-3’。用DNA試劑盒提取植物DNA， PCR體系為20 μl，包括DNA模板2 μl，上下游引物各1 μl，2×TaqMaster Mix DNA聚合酶10 μl，ddH2O 6 μl。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性 5 min， 94 ℃變性45 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s ，37個循環(huán)，最后 72 ℃延伸 10 min， 4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1.2 %的瓊脂糖凝膠在電壓 5 V/cm 條件下電泳 20 min，以 100 bp DNA Marker 為標(biāo)準(zhǔn)分子量，用凝膠成像儀觀察是否存在所要檢測片段。

表1 引物、產(chǎn)物和PCR條件統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄抗性基因檢測

為了試驗的準(zhǔn)確性，在試驗之初需對參試材料中的抗病基因類型進(jìn)行分子標(biāo)記的鑒定。經(jīng)鑒定確認(rèn)，TY52-0純合含Ty-1基因，CLN2777A-0純合含Ty-2基因，99S-C-39-20-11-24-17-0-0純合含含Ty-1基因和Ty-3基因，AVTO1227純合含Ty-5基因，1106F2-1-2-0-7純合含Ty-1 基因和Ty-3a基因，10-A-GY-13-12-1-1-0純合含Ty-1 基因和Ty-3a基因，GT9320-0和moneymaker不含抗性基因(圖1)。

2.2 番茄材料病情調(diào)查與分析

接種35 d后，2種感病材料和3種抗病材料均觀察到TYLCD的典型癥狀。感病材料表現(xiàn)為葉片從外緣向內(nèi)黃化、皺縮、邊緣向上卷曲，新葉舒展不開，葉脈突出，植株矮化并停止生長?？共〔牧系陌Y狀相對較輕，表現(xiàn)為葉片輕微黃化卷曲，植株繼續(xù)生長但未停止生。其他3種抗病材料均未觀察到發(fā)病癥狀(圖2)。

病情指數(shù)是衡量品種抗病性的評價參數(shù)，是將植株病株率與發(fā)病嚴(yán)重程度結(jié)合起來的綜合指標(biāo)。在接種后35 d，2個感病材料，病情指數(shù)均高達(dá)100，病株率高達(dá)100 %，二者一致，表明發(fā)病情況很嚴(yán)重?？共〔牧现校琓Y52-0病情指數(shù)和病株率均最高，分別為20.83 %和36.67 %,10-A-GY-13-12-1-1-0次之，病情指數(shù)和病株率分別為15.00 %和30.00 %，99S-C-39-20-11-24-17-0-0病情指數(shù)為12.50，病株率達(dá)16.67 %。CLN2777A-0、AVTO1227、1106F2-1-2-0-7未觀察到發(fā)病癥狀。從表2可見，所有抗病材料病情指數(shù)均低于21，病株率均低于40 %，表明對TYLCV具有一定抗性。

a：Ty-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b：Ty-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c：Ty-3/Ty-3a PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；d：Ty-5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M ：100 bp DNA ladder marker；1～8：TY52-0、CLN2777A-0、99S-C-39-20-11-24-17-0-0、AVTO1227、1106F2-1-2-0-7、10-A-GY-13-12-1-1-0、GT9320-0和moneymaker圖1 抗性基因檢測 Fig.1 Detection of resistance genes

a～h：TY52-0、CLN2777A-0、99S-C-39-20-11-24-17-0-0、AVTO1227、10-A-GY-13-12-1-1-0、moneymaker、1106F2-1-2-0-7和GT9320-0圖2 各番茄品種接種TYLCV 35 d后的發(fā)病癥狀比較Fig.2 Symptoms of different tomato varieties by TYLCV 35 days after inoculation

如表3所示，櫻桃番茄GT9320-0在接種后15 d發(fā)病，病株率達(dá)6.67 %，與此同時，moneymaker發(fā)病較櫻桃番茄GT9320-0晚，病株率較櫻桃番茄GT9320-0低 。但在接種后35 d，2個感病材料全部發(fā)病，病株率均為100 %。表明評價不同抗病材料的抗性，需要相同果型的感病材料做對照。

2.3 PCR檢測帶毒率

TY52-0的檢測結(jié)果如圖3所示，8份試驗材料在接種后42 d的PCR檢測帶毒率均為100 %。其他7種試驗材料與TY52-0的檢測結(jié)果相同。

3 討 論

番茄黃化曲葉病毒病具有發(fā)病率高、危害大、防治難、傳播效率高等特點(diǎn)，侵染番茄的植物雙生病毒為單鏈、環(huán)狀DNA病毒，病毒重組和變異率高更增加了病毒病防治難度，雖然通過化學(xué)防治、物理防治等方法可以對傳毒媒介煙粉虱進(jìn)行一定程度上的控制，但效果不佳，易反復(fù)發(fā)作。而培育抗病新品種是最為有效、持久的防治方法。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，抗黃化曲葉病基因及其相關(guān)抗病機(jī)理方面的研究取得了很多新的研究成果，在抗病育種方面發(fā)揮著積極的推動作用[18]。目前已經(jīng)從野生番茄材料中找到 6 個抗 TYLCV 的基因，這 6 個基因在很多方面具有不同的特性。由于各地的病毒可能存在核苷酸的變異，因此在開展品種選育前，需要針對當(dāng)?shù)氐牟《绢愋?，針對性的對抗病材料進(jìn)行篩選。本次試驗選用含有不同抗TYLCV基因的番茄材料，比較含有不同基因番茄材料的抗性，為培育番茄新品種提供理論依據(jù)。

表2 各番茄品種接種TYLCV 35 d后的病情統(tǒng)計

表3 Moneymaker和GT9320-0接種TYLCV后的病情統(tǒng)計

M：100 bp DNA ladder marker ；1：陰性對照； 2 ：陽性對照； 3～32：TY52-0圖3 TY52-0接種 TYLCV 35 d后 的 PCR 檢測Fig.3 PCR results of TY52-0 by TYLCV 35 days after inoculation

如何對材料抗性作出客觀評價，是進(jìn)行品種選育前的必要準(zhǔn)備工作。本文選用田間煙粉虱接種，對不同材料的病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查。將植株病株率與發(fā)病嚴(yán)重程度結(jié)合起來進(jìn)行評價。同時還對帶毒率進(jìn)行了檢測。PCR檢測帶毒率結(jié)果顯示，在抗病材料和感病材料中均檢測出攜帶病毒。因此在對材料抗性進(jìn)行鑒定時，不能只依據(jù)病毒含量的多少，還應(yīng)當(dāng)綜合病情指數(shù)和發(fā)病癥狀等多個指標(biāo)對試驗材料進(jìn)行評價。此外，病情調(diào)查顯示，大果型番茄和櫻桃番茄的發(fā)病率在不同時期有所不同，因此本文在對不同類型番茄材料進(jìn)行評價時，選取了普通番茄和櫻桃番茄同時作為感病對照。

10-A-GY-13-12-1-1-0在接種42 d后病情指數(shù)和病株率分別為15.00 % 和30.00 %，含相同抗性基因的櫻桃番茄材料1106F2-1-2-0-7在接種42 d后未觀察到發(fā)病癥狀。推測可能是含有微效抗性基因在抗病過程中發(fā)生作用。綜合評價，Ty-2和Ty-5基因?qū)K地區(qū)TYLCV病毒種類抗性較好，Ty-3次之，Ty-1 抗性相對較弱，Ty-3a在櫻桃番茄中抗性強(qiáng)于大果型番茄。本實驗為抗病育種過程中對抗病基因的選擇提供了依據(jù)。針對于病毒變異快的特點(diǎn)，不同地區(qū)病毒種類存在差異的特點(diǎn),在育種過程中，還需將抗性表現(xiàn)優(yōu)良的基因進(jìn)行聚合育種，使品種的抗病能力提高，這是番茄抗TYLCV育種的重要工作。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Resistance Evaluation of Different Genotype Tomato Lines to Tomato Yellow Leaf Curl Virus

LI Ya-ru1,2，WANG Yin-lei1*，ZHAO Li-ping1，YANG Ma-li1，JIANG Jing1,2，ZHAO Tong-min1**，YU Wen-gui1,2**

(1.Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Nanjing 210014, China; 2.College of Horticulture，Nanjing Agricultural University, Jiangsu Nanjing 210095, China)

To assess resistant levels of genes is an important part of the breeding tomato for disease resistance, six resistant tomato lines and two susceptible tomato lines by whiteflies were infected to tomato yellow leaf curl virus(TYLCV), and their disease index, disease incidence and poisoned rate to assess resistant levels of different resistance genes were counted and analyzed. The results showed that all infected tomatoes carried TYLCV by detection, of which the materials containingTy-2 andTy-5 performed superior resistance to TYLCV of Jiangsu, the second one wasTy-3, andTy-1 was relatively weak. The resistance ofTy-3ain cherry tomatoes was stronger than that in big fruit type tomatoes. This study provided a basis for breeding tomato of disease resistance.

Tomato; Tomato yellow leaf curl virus; Resistance gene; Resistance evaluation; Resistant line

1001-4829(2016)11-2609-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.018

2015-11-10

國家自然科學(xué)青年基金(31401884)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項[ZX(15)4022]

李亞茹(1990-)，女，河北石家莊人，碩士研究生,研究方向為蔬菜遺傳育種，E-mail：yrlisecrect@163.com；*為同等貢獻(xiàn)第一作者：王銀磊(1983-)，男，河北阜平人，副研究員，博士，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)，E-mail：yinleiwang@163.com,**為通訊作者。

S436.412

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