王麗麗 謝榮輝 鄔亞華 張義平 曹 俊 殷嫦嫦

(九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000)

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藜蒿黃酮對(duì)SMMC7721生長抑制作用及其與缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的關(guān)系

王麗麗 謝榮輝1鄔亞華 張義平 曹 俊 殷嫦嫦

(九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 九江 332000)

目的 探討藜蒿黃酮對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721的抑制作用，并觀察其與缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α表達(dá)的關(guān)系。方法 實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組、槲皮素組、藜蒿黃酮組；CCK-8法檢測各組細(xì)胞的生長抑制作用；用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況；RT-PCR檢測各組HIF-1α表達(dá)。結(jié)果 與陰性對(duì)照組比較，藜蒿黃酮能明顯抑制SMMC7721細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，呈時(shí)間、劑量依賴性(P<0.05)，IC50為345 μg/ml；RT-PCR結(jié)果顯示藜蒿黃酮組HIF-α表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論 藜蒿黃酮能抑制SMMC7721細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與HIF-1α表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

藜蒿黃酮；SMMC7721；缺氧誘導(dǎo)因子；細(xì)胞凋亡

缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一〔1〕，能夠引起腫瘤細(xì)胞的一些基因表達(dá)發(fā)生改變，導(dǎo)致組織供血、供氧和供能的增加，促進(jìn)腫瘤的生長、血管形成、轉(zhuǎn)移。而這些基因表達(dá)的改變是由缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α這種在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物及人體的一種轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的〔2,3〕。因此，在抗腫瘤治療及其輔助治療中，尋找HIF-1α的抑制性物質(zhì)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。生長于鄱陽湖畔的藜蒿是一種草本植物，其鮮嫩莖桿和肉質(zhì)莖均為本地百姓“飯桌上的寶”，藜蒿中含有黃酮化合物，研究表明植物黃酮具有多種生物活性〔4〕，如降血糖血脂、抗心律失常、抗人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)、抗自由基、抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤〔5～10〕等。我們前期研究證實(shí)：藜蒿黃酮粗提物對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC7721的生長有抑制作用〔11〕，為了進(jìn)一步研究藜蒿黃酮對(duì)肝癌細(xì)胞的作用，我們將藜蒿黃酮粗提物進(jìn)行了初步純化，將純化后的黃酮作用于SMMC7721，觀察其抑制SMMC7721作用及與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 肝癌細(xì)胞株SMMC7721(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院江西省消化疾病研究所)；人正常肝細(xì)胞L-02(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；藜蒿(采摘于鄱陽湖畔)；二甲基亞砜(DMSO)、0.25%胰蛋白酶、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(Solarbio公司)；緩沖液培養(yǎng)基(DMEM，Gbico公司)；總RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；胎牛血清、RT-PCR試劑(TransGen公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)(SIM公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，HIF-1α上游引物：5'-TGCATCTCCATCTCCTACCC-3',下游引物：5'-TGGTCAGCTGTGGTAATCCA-3'；GAPDH基因上游引物：5'-TGCATCTCCATCTCCTACCC-3',下游引物：5'-TGGTCAGCTGTGGTAATCCA-3'。

1.2 細(xì)胞增殖活力檢測(CCK-8實(shí)驗(yàn)) 超聲波輔助法提取藜蒿黃酮〔12，13〕，以聚酰胺純化，并通過鹽酸-鎂粉還原反應(yīng)進(jìn)行鑒定后，選對(duì)數(shù)期生長的肝細(xì)胞(L-02)和肝癌SMMC7721細(xì)胞，以4 000/孔的濃度接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且生長良好。實(shí)驗(yàn)分L-02細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞兩部分，各分3大組：陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(終濃度為400 nmol/L的槲皮素)、藜蒿黃酮組(終濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 μg/ml)，每個(gè)濃度的藥物均設(shè)藥物空白對(duì)照孔。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，以PBS輕柔沖洗2次，每孔加入新鮮培養(yǎng)基200、10 μl CCK-8，分別培養(yǎng)2、4 h，以酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值A(chǔ)450，以僅加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔作為空白孔進(jìn)行調(diào)零，計(jì)算不同濃度藜蒿黃酮作用的增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3 細(xì)胞凋亡流式檢測 24孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)肝癌SMMC7721細(xì)胞，待生長良好后分4組：空白組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(槲皮素組)及終濃度為345 μg/ml(即IC50濃度)的藜蒿黃酮組。于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105/ml，取1 ml細(xì)胞懸液1 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；加入1 ml冷PBS重懸，同上操作并重復(fù)2次；再重懸于200 μl上樣緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC,避光室溫反應(yīng)15 min，加入10 μl PI和300 μl上樣緩沖液。并快速用流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果分析。在檢測時(shí)，我們將整個(gè)界面分為4個(gè)亞群：機(jī)械性損傷細(xì)胞、正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和繼發(fā)性壞死細(xì)胞。

1.4 RT-PCR檢測HIF-1α 6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)肝癌SMMC7721細(xì)胞，待生長良好后如上分四組，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，按RNA快速提取試劑盒說明提取RNA，并進(jìn)行RNA純度、完整性鑒定后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)PCR擴(kuò)增(內(nèi)參為GAPDH基因)。使用SIM凝膠成像系統(tǒng)掃描分析并行相關(guān)基因相對(duì)于管家基因GAPDH的相對(duì)表達(dá)率半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖活力檢測 利用CCK-8法檢測不同濃度(62.5、125、250、500、1 000 μg/ml)藜蒿黃酮對(duì)肝L-02細(xì)胞、肝癌SMMC7721細(xì)胞的影響，見表1，各濃度藜蒿黃酮作用下的肝L-02細(xì)胞正常生長(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖活性均有所降低，且隨作用濃度的增加，降低程度也有所增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，500、1 000 μg/ml組與陰性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)，250 μg/ml組與陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藜蒿黃酮作用24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為345 μg/ml。

2.2 顯微鏡下可見 陰性對(duì)照組肝癌SMMC7721細(xì)胞生長明顯增殖;各組正常肝細(xì)胞于加藜蒿黃酮前后無變化，細(xì)胞正常生長；各濃度組肝癌細(xì)胞的生長都出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，呈濃度依賴性。500 μg/ml藜蒿黃酮在作用24 h，肝癌細(xì)胞生長出現(xiàn)明顯抑制、細(xì)胞收縮變圓，還有一些細(xì)胞裂解，48 h，多數(shù)細(xì)胞已看不見完整的結(jié)構(gòu)，周圍出現(xiàn)細(xì)胞碎片；陽性對(duì)照組肝癌細(xì)胞在24 h細(xì)胞略有收縮，但不甚明顯，48 h細(xì)胞大量變圓、裂解死亡，見圖1。

2.3 藜蒿黃酮作用SMMC7721細(xì)胞24 h細(xì)胞收縮變圓，繼而細(xì)胞裂解，整個(gè)過程未出現(xiàn)細(xì)胞體積變大和溶解，據(jù)此可初步說明藜蒿黃酮可誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡。藥物作用48 h藜蒿黃酮組(4.001)凋亡率為95.73%，陰性對(duì)照組(2.001)凋亡率為1.67%，而槲皮素組(3.001)凋亡細(xì)胞占28.37%，該結(jié)果進(jìn)一步說明藜蒿黃酮有促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞凋亡的作用。

2.4 RT-PCR檢測HIF-1α 實(shí)驗(yàn)各組RNA提取后，OD260/OD280為1.83，純度較好；完整性鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可明顯見兩條帶(28S、18S)，逆轉(zhuǎn)錄后各組PCR電泳結(jié)果如圖2。經(jīng)瓊脂糖電泳后，以HIF-1α與內(nèi)參的灰度比求得各組相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量，可見藜蒿黃酮組(0.052 9±0.002 9)、陽性對(duì)照組(0.134 9±0.011 5)與陰性對(duì)照組(0.214 9±0.005 4)之間差異較大(P<0.05),說明藜蒿黃酮與槲皮素對(duì)HIF-1α的表達(dá)有抑制作用?？瞻捉M為0.217 7±0.008 2。

表1 藜蒿黃酮作用L-02、SMMC7721細(xì)胞24 h CCK-8檢測吸光度(A值)比較

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

A:24 h SMCC7721;B:48 h SMCC7721;C:24 h L-02(500 μg/ml藜蒿黃酮);D:48 h L-02(500 μg/ml藜蒿黃酮);E:24 h SMMC7721(500 μg/ml藜蒿黃酮);F：48 h SMMC7721(500 μg/ml藜蒿黃酮);G:24 h SMMC7721(400 nmol/L槲皮素);H:48 h SMMC7721(400 nmol/L槲皮素)圖1 藜蒿黃酮作用L-02、SMMC7721細(xì)胞24 h和48 h細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

M:Marker,1～4:藜蒿黃酮組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、空白組圖2 RT-PCR檢測各組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)

3 討 論

MTT法是檢測細(xì)胞增殖活性的常規(guī)方法〔14,15〕，但用該法檢測藜蒿黃酮對(duì)SMMC7721增殖活性過程中，我們發(fā)現(xiàn)：藜蒿黃酮的吸光度波長峰值與MTT檢測法的波長接近，再者M(jìn)TT實(shí)驗(yàn)過程要完全棄去上清液，因此無法通過增設(shè)藥物空白消除藜蒿黃酮本底的干擾，因此我們改用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，該方法通過設(shè)置藥物空白對(duì)照可消除藥物本底的干擾。因此我們認(rèn)為在研究黃酮對(duì)細(xì)胞增殖活性最好選用CCK-8方法或其他可設(shè)置藥物空白實(shí)驗(yàn)方法。本研究結(jié)果顯示：藜蒿黃酮能抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖活性，呈時(shí)間、濃度依賴性，而對(duì)人正常肝細(xì)胞的生長有輕度抑制作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞凋亡是一種多基因嚴(yán)格控制的基本生物學(xué)現(xiàn)象，是細(xì)胞自主、有序的死亡，其常由單個(gè)細(xì)胞開始，先出現(xiàn)細(xì)胞體積的縮小、與周圍細(xì)胞分離，然后細(xì)胞質(zhì)聚集、細(xì)胞膜的通透性增加，但整個(gè)過程中，細(xì)胞膜的完整性很好，其與細(xì)胞壞死是有本質(zhì)的區(qū)別的。壞死是一種無序變化的死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積脹大、細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物外溢，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。本文結(jié)果可初步說明藜蒿黃酮可誘導(dǎo)及促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞凋亡，但僅從這兩方面還不能完全說明藜蒿黃酮誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡,在以后的研究中,我們將進(jìn)行熒光染色觀察細(xì)胞凋亡、DNA電泳、線粒體電位測定等方法進(jìn)一步觀察藜蒿黃酮誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡作用。

HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤組織中廣泛表達(dá)，能與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)多種基因表達(dá)上調(diào)〔16〕，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管形成〔17,18〕、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移起到非常重要的作用〔19,20〕。HIF-1α作為HIF-1的一個(gè)重要亞基，其突出地位無可取代。本研究說明藜蒿黃酮及槲皮素能在轉(zhuǎn)錄水平抑制肝癌細(xì)胞株SMMC7721中HIF-1α基因表達(dá)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似〔21〕。HIF-1除了在腫瘤細(xì)胞耐受缺氧方面起重要作用外，還能調(diào)節(jié)腫瘤的凋亡〔22,23〕。有研究表明，HIF-1影響Survivin、bcl-2 mRNA及bax蛋白的表達(dá)，故推測，藜蒿黃酮可能通過抑制HIF-1α的表達(dá)，使Survivin和bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)減少，而bax蛋白表達(dá)增高，進(jìn)而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的目的。

盡管體外的細(xì)胞水平研究結(jié)果支持藜蒿黃酮具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，但其進(jìn)入體內(nèi)代謝后是否能保留其生物學(xué)活性，即在體內(nèi)是否具有防治肝癌的作用還需通過血清藥理學(xué)及建立肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

江西省教育廳青年基金項(xiàng)目(GJJ10265)

殷嫦嫦(1960-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

王麗麗(1979-)，女，講師，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

R966

A

1005-9202(2016)22-5521-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.012

1 九江市第一人民醫(yī)院