葉勵(lì)超 蔡若蔚 黃玉婷 林若庭 陳繼興

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 泉州 362000)

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血清miR-96、miR-326在多發(fā)性硬化復(fù)發(fā)、緩解期表達(dá)水平的變化

葉勵(lì)超 蔡若蔚 黃玉婷1林若庭 陳繼興

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 泉州 362000)

目的 探討血清miR-96、miR-326表達(dá)水平與緩解-復(fù)發(fā)型多發(fā)性硬化(RRMS)的關(guān)系并評價(jià)其臨床意義。方法 RRMS患者57例，其中復(fù)發(fā)期(急性期)組32例，緩解期組25例，正常對照組30例；用熒光定量PCR檢測血清miR-96，miR-326相對表達(dá)量。結(jié)果 與RRMS復(fù)發(fā)期組和正常對照組比較，緩解期組血清miR-96相對表達(dá)量明顯增高(P<0.001)；與RRMS緩解期組和正常對照組比較，復(fù)發(fā)期組血清miR-326相對表達(dá)量明顯增高(P<0.001)。RRMS緩解期組血清miR-96相對表達(dá)量與擴(kuò)大的殘疾功能狀態(tài)評分(EDSS)無相關(guān)性(r=0.22，P=0.30)，RRMS復(fù)發(fā)期組血清miR-326相對表達(dá)量與EDSS評分無相關(guān)性(r=-0.18，P=0.31)。結(jié)論 血清miR-96、miR-326與RRMS的炎癥活動(dòng)密切相關(guān)，可作為監(jiān)測RRMS活動(dòng)性的候選生物標(biāo)記物。

多發(fā)性硬化；微小RNA；miR-96；miR-326

多發(fā)性硬化(MS)是一種自身免疫性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)受累為主，臨床特點(diǎn)是病灶的空間多發(fā)性和時(shí)間多發(fā)性。復(fù)發(fā)緩解型(RR)是MS最常見的類型，以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀急性加重，伴完全或不完全緩解為特征。由于MS致病原因仍不清楚，臨床表現(xiàn)多樣及治療反應(yīng)不一，因此，各國學(xué)者都期待找出一種或幾種可靠的生物學(xué)標(biāo)志物，能夠有助于監(jiān)測 MS的病情進(jìn)展及反映 MS 對于治療的效果，但結(jié)果卻不盡如人意〔1〕。微小RNA(miRNA)是一類長度21～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子組成的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，參與人類生命活動(dòng)及疾病進(jìn)程的調(diào)控，例如細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、代謝、凋亡、血管生成、炎癥和免疫〔2〕。miRNA表達(dá)和功能異常與癌癥、神經(jīng)變性和自身免疫疾病有關(guān)。在MS患者的病灶、血液、腦脊液及外周血單個(gè)核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種miRNA表達(dá)異常，提示其參與了MS的病理生理過程〔3～6〕。本研究通過檢測RRMS患者復(fù)發(fā)期與緩解期血清miR-96與miR-326表達(dá)水平，探討其與MS炎癥活動(dòng)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2015年7月我院神經(jīng)內(nèi)科確診RRMS 57例，排除合并肝腎疾病、腫瘤、糖尿病、急性感染、心腦血管疾病及其他自身免疫性疾病患者。RRMS診斷參照2010年修訂的McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕。RRMS復(fù)發(fā)期(急性期)組：32例，男9例，女23例；年齡21～60歲，平均(37.3±9.2)歲；病程10～98個(gè)月，平均(55.8±15.2)個(gè)月；擴(kuò)大的殘疾功能狀態(tài)評分(EDSS)2.5～8.0分，平均(5.3±1.3)分。RRMS緩解期組：25例，男7例，女18例；年齡20～58歲，平均(38.4±7.9)歲；病程12～120個(gè)月，平均(60.4±18.6)個(gè)月；EDSS 1.0～7.0分，平均(3.1±1.2)分。正常對照組：健康體檢者30例，男8例，女22例；年齡18～60歲，平均(38.5±8.7)歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法 兩組患者皆于清晨空腹抽取肘靜脈血2 ml，低溫快速離心，30 min內(nèi)分裝200 μl血清于凍存管中，-80℃保存。

1.2.1 純化miRNA和總RNA 將放于-80℃冰箱的血清樣本200 μl，放在冰上，標(biāo)本融化后加入3倍體積的 Trizol LS (Invitrogen，美國)震蕩混勻，再加入0.5 ml氯仿震蕩混勻，置于低溫離心機(jī)，4℃以12 000 r/min 離心15 min，取上清，加入1.5 倍體積的無水乙醇，按照miRNeasy mini kit試劑盒(QIAGEN，德國)說明書步驟完成提取，獲得的RNA溶解于200 μl無 RNase雙蒸水中備用。

1.2.2 檢測miRNA 使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(TIANGEN，中國)分別進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μl，包括第一鏈合成cDNA、miRcute miRNA premix及引物(應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；然后94℃ 20 s、60℃ 35 s，進(jìn)行35～45個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以miR-16作為內(nèi)參。血清miR-96、miR-326 相對表達(dá)量計(jì)算公式為2-△△CT。每個(gè)樣品測定3次取平均值，同時(shí)做空白組以提高實(shí)驗(yàn)可靠性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS10.0軟件行Pearson檢驗(yàn)。

表1 相關(guān)基因定量PCR 引物設(shè)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR-96、miR-326的相對表達(dá)水平比較 與RRMS復(fù)發(fā)期組和正常對照組比較，緩解期組血清miR-96相對表達(dá)量明顯增高(P<0.001)。與RRMS緩解期組和正常對照組比較，復(fù)發(fā)期組血清miR-326相對表達(dá)量明顯增高(P<0.001)，見表2。

2.2 血清miR-96、miR-326相對表達(dá)量與RRMS嚴(yán)重程度相關(guān)性 RRMS緩解期組血清miR-96相對表達(dá)量與EDSS評分無相關(guān)性(r=0.22，P=0.30)，RRMS復(fù)發(fā)期組血清miR-326相對表達(dá)量與EDSS評分無相關(guān)性(r=-0.18，P=0.31)，見圖1和圖2。

表2 3組血清miR-96、miR-326相對表達(dá)量

圖1 RRMS緩解期組血清miR-96相對表達(dá)量與EDSS評分相關(guān)性

圖2 RRMS復(fù)發(fā)期組血清miR-326相對表達(dá)量與EDSS評分相關(guān)性

3 討 論

MS是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘疾病，病因尚不明確，但CD4+T細(xì)胞在發(fā)病機(jī)制中扮演著至關(guān)重要的角色。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)異常與MS等自身免疫性疾病存在明確關(guān)聯(lián)，MS發(fā)病過程中存在特異性miRNA 表達(dá)模式，miRNA通過影響巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化和激活調(diào)控免疫功能，這可能是導(dǎo)致MS發(fā)病的啟動(dòng)因素〔8～12〕。許多miRNA在血液、腦脊液等體液中存在一定的表達(dá)豐度且理化特性穩(wěn)定，能夠作為疾病的生物標(biāo)志物，循環(huán)miRNA 也因此成為MS研究的熱點(diǎn)〔13，14〕。國外學(xué)者通過檢測RRMS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)100多種miRNA明顯表達(dá)異常，其中一部分是 MS 潛在生物學(xué)標(biāo)志物〔15〕。

miR-96屬于miR-183家族成員，定位于人類染色體7q32。本研究與Otaegui等〔16〕研究結(jié)果一致，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用基因處理工具尋找特異性miRNA 的靶基因及其可能參與的信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-96調(diào)節(jié)的靶基因主要參與經(jīng)典免疫相關(guān)通路(如白細(xì)胞介素信號通路、Ⅰ組代謝型谷氨酸受體通路等)和 Wnt信號通路的調(diào)控。在MS發(fā)病過程中，前者參與谷氨酸介導(dǎo)的毒性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)T細(xì)胞的激活，后者參與效應(yīng)T細(xì)胞的發(fā)育和調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化。miR-96表達(dá)增加可以抑制相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄后蛋白表達(dá)，從而干擾相關(guān)免疫通路，減輕MS炎癥反應(yīng)〔17〕。因此，血清miR-96有可能作為RRMS緩解期的一種潛在生物標(biāo)記物。

高表達(dá)的 miRNA-326 可以抑制靶基因產(chǎn)物 Ets-1(一種調(diào)節(jié)Th17分化的負(fù)性因子)的表達(dá)，促進(jìn)原始 CD4+T 細(xì)胞向 Th17 細(xì)胞的分化，加重 MS 患者病情。Du等〔18〕證實(shí)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠外周血中Th17 細(xì)胞數(shù)目異常增高，并且與miRNA-326 表達(dá)水平呈正相關(guān)。RRMS復(fù)發(fā)期患者外周血淋巴細(xì)胞miRNA-326與miR-26a 表達(dá)水平明顯升高，根據(jù)ROC曲線分析，miR-326有近100%的敏感性和特異性鑒別RRMS復(fù)發(fā)與緩解〔19〕。因此，血清miRNA-326表達(dá)水平可以反映RRMS復(fù)發(fā)期炎癥活動(dòng)情況。EDSS評分反映的是患者神經(jīng)功能缺損程度和日常生活能力，而血清miR-96、miR-326表達(dá)水平間接反映MS炎癥活動(dòng)情況。但是Kacperska等〔14〕發(fā)現(xiàn)miR-92a表達(dá)水平與RRMS復(fù)發(fā)期患者EDSS評分存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。綜上，血清miR-96、miR-326與RRMS的炎癥活動(dòng)密切相關(guān)，可作為監(jiān)測RRMS活動(dòng)性的候選生物標(biāo)記物。

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〔2015-03-18修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省教育廳科技項(xiàng)目(No.JB13075);泉州市技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(No.2015Z33)

葉勵(lì)超(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)免疫和腦血管病研究。

R774.6

A

1005-9202(2016)22-5519-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.011

1 檢驗(yàn)科