董海影 張 春 弓 箭 張曉杰 李春旭

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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芍藥苷對(duì)大鼠皮質(zhì)酮損傷的海馬神經(jīng)元TrkB/BDNF信號(hào)通路的影響

董海影 張 春1弓 箭 張曉杰 李春旭

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察芍藥苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的影響。方法 體外培養(yǎng)新生SD大鼠海馬神經(jīng)元，采用皮質(zhì)酮誘導(dǎo)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元建立皮質(zhì)酮損傷模型。培養(yǎng)體系中加入不同濃度的芍藥苷進(jìn)行預(yù)處理。采用WST-1法檢測(cè)芍藥苷對(duì)神經(jīng)元存活率的影響，應(yīng)用PCR與Western印跡檢測(cè)神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)與酪氨酸激酶受體B(TrkB)的表達(dá)。結(jié)果 與皮質(zhì)酮組相比，中高劑量芍藥苷可明顯增加海馬神經(jīng)元活力(P<0.05)，可明顯增加海馬神經(jīng)元TrkB與BDNF的 mRNA與蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論 芍藥苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，具有抗抑郁作用。

芍藥苷；海馬神經(jīng)元；TrkB/BDNF

芍藥具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、平抑肝陽等功效，主要有效成分為芍藥苷〔1〕，具有顯著的抗抑郁樣活性〔2〕。本實(shí)驗(yàn)主要研究芍藥苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB)表達(dá)的影響，進(jìn)而探討芍藥苷抗抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及動(dòng)物 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：23180-57-6)；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(Beyotime公司，P20028)；TRIzon Reagent 總RNA提取試劑盒，Prime ScriptTMRT reagent Kit(TaRaKa，cat：RR370A)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，cat：RR420A)。原代海馬神經(jīng)元源于新生24 h的SD大鼠的乳鼠，清潔級(jí)，雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 選取新生24 h內(nèi)的SD大鼠的乳鼠，將其置于無菌環(huán)境下，借助于解剖顯微鏡取出海馬，將收集的海馬組織修剪為約1 mm3，置于預(yù)冷的HBSS培養(yǎng)皿中，加入預(yù)熱的0.25%EDTA-胰蛋白酶溶液，在37℃水浴條件下消化15 min；應(yīng)用牛血清終止反應(yīng)后棄掉上清液，應(yīng)用HBSS洗滌；加入種植液，吸取上清液置于離心管中，細(xì)胞濃度調(diào)整為(0.5～1)×107個(gè)/ml，接種于6孔板、24孔板和96孔板；待24 h貼壁后換為飼養(yǎng)液，抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，7 d用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 海馬神經(jīng)元的鑒定 應(yīng)用Nissl染色方法進(jìn)行鑒定。將細(xì)胞接種于6孔板，采用4%多聚甲醛固定，Nissl染色，蒸餾水和乙醇洗滌，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 神經(jīng)元分組 原代神經(jīng)元培養(yǎng)第7天后，分為空白對(duì)照組，皮質(zhì)酮組(200 μmol/L)，芍藥苷組(0.1、1、10 μmol/L)。芍藥苷各組先加入芍藥苷預(yù)處理48 h后，再加入皮質(zhì)酮損傷神經(jīng)元共孵育24 h。

1.2.4 WST-1檢測(cè)海馬神經(jīng)元增殖活性 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)于96孔板，然后孔內(nèi)加入10 μl WST-1工作液，在5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)4 h，檢測(cè)OD值。

1.2.5 PCR檢測(cè)海馬神經(jīng)元TrkB與BDNF的mRNA表達(dá) 首先采用光度計(jì)和凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行純度、濃度和完整性檢測(cè)；然后借助Prime ScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)85℃ 5 s。PCR反應(yīng)引物由TaKaRa 公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：TrkB正義：5＇-GGGGCTTATGCTTGCTGGTC-3＇；反義：5＇-CTCTGGGTCATTGCTGTTAGGTT-3＇；BDNF正義：5＇-CCCTTCTACACTTTACCTCTT-3＇；反義：5＇-GTTTCACCCTTTCCACTCCTA-3＇。

1.2.6 Western印跡檢測(cè)TrkB與BDNF蛋白水平的表達(dá) 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加抗，曝光。最后應(yīng)用ImageJ2x分析軟件分析條帶灰度，進(jìn)行半定量比較分析，以目的基因條帶與內(nèi)參基因GAPDH的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組海馬神經(jīng)元WST-1檢測(cè)結(jié)果 與空白對(duì)照組(1.308±0.081)比較，皮質(zhì)酮組細(xì)胞活力(0.688±0.059)明顯降低(P<0.05)；與皮質(zhì)酮組比較，芍藥苷0.1 μmol/L組(0.597±0.101)無明顯差異(P>0.05)，芍藥苷1 μmol/L組(1.323±0.978)與芍藥苷10 μmol/L組(1.319±0.130)的細(xì)胞活力明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且二者相比無明顯差異(P>0.05)。

2.2 各組海馬神經(jīng)元TrkB與BDNF mRNA檢測(cè)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，皮質(zhì)酮組TrkB與BDNF mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；而與皮質(zhì)酮組相比，芍藥苷0.1 μmol/L組無明顯差異(P>0.05)，芍藥苷1 μmol/L組與芍藥苷10 μmol/L組的TrkB與BDNF mRNA表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 各組海馬神經(jīng)元TrkB與BDNF蛋白水平檢測(cè) 與空白對(duì)照組比較，皮質(zhì)酮組TrkB與BDNF 蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；而與皮質(zhì)酮組相比，芍藥苷0.1 μmol/L組無明顯差異(P>0.05)，芍藥苷1 μmol/L組與芍藥苷10 μmol/L組的TrkB與BDNF蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表1 各組海馬神經(jīng)元TrkB與BDNF mRNA表達(dá)的比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與皮質(zhì)酮組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組海馬神經(jīng)元TrkB與BDNF 蛋白表達(dá)的比較

A：空白對(duì)照組；B：皮質(zhì)酮組；C：芍藥苷0.1 μmol/L組；D：芍藥苷1 μmol/L組；E：芍藥苷10 μmol/L組圖1 TrkB與BDNF的Western印跡檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

芍藥苷是提取于芍藥中的中藥單體，是芍藥的主要活性成分，不僅具有抗炎、抗過敏、改善認(rèn)知能力和改善血循環(huán)等多種藥理作用，還具有抗抑郁樣活性〔3〕。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，芍藥苷在抑郁癥經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，能夠顯著縮短行為絕望模型小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，提示芍藥苷具有一定的抗抑郁作用。神經(jīng)病理學(xué)研究結(jié)果顯示，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與腦內(nèi)重要邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)——海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的萎縮和壞死有重要關(guān)系〔4〕。臨床的影像學(xué)研究資料亦提示，與正常人的大腦海馬體積相比，抑郁癥患者海馬體積明顯縮小，且縮小程度與抑郁持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)〔5〕。諸多研究結(jié)果證實(shí)抑郁癥的發(fā)病與海馬結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。因此，如果能夠激活海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)成年腦神經(jīng)元再生，將有可能是抑郁癥治療的一個(gè)突破性變革。BDNF作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族中的重要成員，主要通過與神經(jīng)元細(xì)胞膜表面受體 Trkb 結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元的發(fā)育、分化、功能維持以及突觸可塑性〔6〕。研究亦發(fā)現(xiàn)，如果增加BDNF及其受體TrkB的表達(dá)強(qiáng)度，進(jìn)而增強(qiáng)其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的作用、促進(jìn)多種類型神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活、分化和功能表達(dá)，同時(shí)也能維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)元的正常功能，也是抗抑郁治療的主要靶向之一〔7〕。

肝郁氣滯證為中醫(yī)證候最常見的證候類型，居各證之首，而柴胡疏肝散是臨床上治療抑郁癥最常用的經(jīng)典名方之一，臨床及實(shí)驗(yàn)研究均顯示該經(jīng)典方劑具有確切的抗抑郁作用〔8，9〕。柴胡疏肝散中白芍與柴胡相伍一散一收，助柴胡疏肝，相反相成共為主藥，而芍藥苷是白芍的主要活性成分〔10〕。本文通過觀察芍藥苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的影響，進(jìn)一步探討芍藥苷抗抑郁癥的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，芍藥苷對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，增加神經(jīng)元活力，還能夠增加與神經(jīng)元突觸可塑性有關(guān)的TrkB和BDNF mRNA表達(dá)水平，說明芍藥苷具有一定的抗抑郁作用。至于其抗抑郁癥具體作用機(jī)制還有待以后進(jìn)一步深入研究。

1 金樹梅，蘇文華，崔廣智.芍藥苷在藥物誘發(fā)抑郁模型中的抗抑郁作用觀察〔J〕.山東醫(yī)藥雜志，2013；53(19)：28-9.

2 Mao QQ，Ip SP，Tsai SH，etal.Antidepressant like effect of peony glycos ides in mice〔J〕.J Ethnopharmacol，2008；119(2)：272.

3 Chen T，Guo ZP，Jiao XY，etal.Peoniflorin suppresses tumor necrosis factor-α induced chemokine production in human dermal microvascular endothelial cells by blocking nuclear factor-κB and ERK pathway〔J〕.Arch Dermatol Res,2011；303(5)：351-60.

4 McEwen BS.Plasticity of the hippocampus：adaptation to chronic stress and allostatic load〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2001；933(3)：265-77.

5 Egger K，Schocke M，Weiss E，etal.Pattern of brain atrophy in elderly patients with depression revealed by voxel-based morphometry〔J〕.Psychiatry Res，2008；164(3)：237-44.

6 張子韜.BDNF信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸形成及遞質(zhì)釋放的機(jī)制研究〔D〕.南京：南京醫(yī)科大學(xué)，2013.

7 Costa MS，Botton PH，Mioranzza S，etal.Caffeine improves adult mice performance in the object recognition task and increases BDNF and TrkB independent on phospho-CREB immunocontent in the hippocampus〔J〕.Neurochem Int，2008；53(3-4)：89-94.

8 董海影，張曉杰.柴胡疏肝散對(duì)抑郁模型大鼠海馬乙酰膽堿代謝的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2011；26(1)：163-7.

9 楊滿菊.柴胡疏肝散改善帕金森病患者抑郁癥狀療效評(píng)價(jià)〔J〕.光明中醫(yī),2010；25(1)：31-2.

10 李春香，丁里玉，丁 芳，等.白芍養(yǎng)血柔肝止痛作用與其配伍及芍藥苷含量的相關(guān)性研究〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2011；22(1)：54-6.

〔2016-05-25修回〕

(編輯 曲 莉)

Effect of Paeoniflorin on the TrkB/BDNF signaling pathway of corticosterone-damaged hippocampal neurons

DONG Hai-Ying,ZHANG Chun,GONG Jian,et al.

Pathology Diagnosis Center of Qiqihar Medical College,Qiqihaer 161006,Heilongjiang,China

Objective To observe the effect of paeoniflorin on the damage of hippocampal neurons induced by corticosterone and investigate the mechanisms of paeoniflorin against depression.Methods Hippocampal neurons derived from newborn SD rats were cultured in vitro,using primary cultured hippocampal neurons induced by corticosterone to set up the corticosterone-injured model.The culture system was added to different concentrations of corticosterone pretreatment.WST-1 assay was used to detect the effect of paeoniflorin on the neuronal survival rate.The expression of TrkB/BDNF was detected by PCR technology.Results Compared with the model group,the medium and high dosage of corticosterone could significantly increase the hippocampal neuronal viability.The differences were significant(P<0.05).The medium and high dosage of corticosterone could obviously enhance the mRNA expression level of TrkB/BDNF(P<0.05).Conclusions Paeoniflorin has protective effect on corticosterone-induced primary cultured hippocampal neurons and antidepressant effect.

Paeoniflorin;Hippocampal neurons;TrkB/BDNF

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173576)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2012-338)

李春旭(1965-)，男，碩士，副教授，主要從事臨床病理學(xué)研究。

董海影(1982-)，女，博士，講師，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

R74

A

1005-9202(2016)22-5499-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.003

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室