林麗梅　周世業(yè)　白丁平

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院　福州　350002；2.國(guó)家水禽品種資源基因庫(kù)　福建石獅　362700）

piggyBac轉(zhuǎn)座子在畜牧獸醫(yī)科學(xué)中應(yīng)用研究進(jìn)展

林麗梅1周世業(yè)2白丁平*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院福州350002；2.國(guó)家水禽品種資源基因庫(kù)福建石獅362700）

piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子已被證明是一種高效的非病毒基因工程操作工具，現(xiàn)廣泛用于基因操作和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中。借助PB轉(zhuǎn)座子已獲得轉(zhuǎn)基因小鼠、雞、豬、山羊等動(dòng)物。文中重點(diǎn)就PB轉(zhuǎn)座子在畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

piggyBac轉(zhuǎn)座子基因工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

PB轉(zhuǎn)座子是一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體，可攜帶外源基因整合到宿主染色體上并實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。鑒于PB轉(zhuǎn)座子整合外源基因的這一優(yōu)勢(shì)，PB轉(zhuǎn)座子在昆蟲(chóng)［1-2］、寄生蟲(chóng)［3-4］和魚(yú)類［5-6］等低等生物中得到了廣泛應(yīng)用。2005年Ding等［7］將PB轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于人和小鼠細(xì)胞的基因功能研究，實(shí)現(xiàn)了外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，并首次用PB轉(zhuǎn)座子獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，從而證實(shí)PB轉(zhuǎn)座子可用于哺乳動(dòng)物基因工程研究。目前，PB轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，在畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。

1　牛研究中應(yīng)用

將PB轉(zhuǎn)座子應(yīng)用到牛的研究中，探索其在?；蚪M中轉(zhuǎn)座效率和整合特性具有十分重要的意義。杜新華等［8］利用PB轉(zhuǎn)座子在?；蚪M中獲得了8個(gè)有效整合位點(diǎn)，其中5個(gè)整合位點(diǎn)定位到牛1、2、11和X染色體上。該研究發(fā)現(xiàn)在?；蚪M中PB轉(zhuǎn)座子5′端傾向于整合到富含GC（62.5%）堿基富集區(qū)。白宏偉等［9］研究發(fā)現(xiàn)PB轉(zhuǎn)座子可明顯提高牛成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，獲得更多轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞。他們?cè)谂；蚪M中研究獲得40個(gè)PB轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)，可定位到牛的14條染色體上。由此說(shuō)明PB轉(zhuǎn)座子在?；蚪M具有高效轉(zhuǎn)座能力。

生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因牛的關(guān)鍵步驟是獲得轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞和制備轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚胎。楊寧等［10］構(gòu)建了以PB轉(zhuǎn)座子為載體元件，增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）為報(bào)告基因，新霉素（NEO）為抗性基因，alpha-肌動(dòng)蛋白為啟動(dòng)子的A-FABP基因特異性表達(dá)載體pPBAFABP。通過(guò)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)獲得表達(dá)目標(biāo)基因A-FABP的牛成纖維細(xì)胞。Su Jin KIM等［11］借助PB轉(zhuǎn)座子將綠色蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（RFP）轉(zhuǎn)入到供體成纖維細(xì)胞中，然后通過(guò)體細(xì)胞核移植（SCNT）制備獲得牛轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚胎，并在重構(gòu)胚胎中實(shí)現(xiàn)了GFP和RFP穩(wěn)定表達(dá)。以上研究表明PB轉(zhuǎn)座子可用于牛的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)中。

多潛能胚胎干細(xì)胞（ES）是開(kāi)展基因敲除和基因沉默的重要工具，借助有效的技術(shù)手段獲得ES細(xì)胞成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。研究已證實(shí)在成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入Oct 4、Sox 2、Klf4和Myc四個(gè)基因，通過(guò)體細(xì)胞重編程可獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells），iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞具有相似的形態(tài)和功能［12］。趙麗霞等［13］借助PB轉(zhuǎn)座子用鼠源的6個(gè)基因（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg、Lrh1）誘導(dǎo)胎牛成纖維細(xì)胞，獲得了牛的iPS細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和免疫組化技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)表達(dá)多能性基因，證實(shí)利用PB轉(zhuǎn)座子可獲得牛iPS細(xì)胞。

2　馬研究中應(yīng)用

馬在博彩業(yè)、娛樂(lè)業(yè)和體育競(jìng)技中具有其他動(dòng)物不可替代的角色。在此類項(xiàng)目中馬也容易患運(yùn)動(dòng)損傷性疾病，從而影響優(yōu)良馬匹的使用壽命。因此獲得有效的治療肌肉、腱、韌帶和關(guān)節(jié)等運(yùn)動(dòng)損傷疾病的方法，對(duì)延長(zhǎng)馬匹使用壽命具有重要意義。Nagy等［14］使用PB轉(zhuǎn)座子將轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc轉(zhuǎn)入到馬成纖維細(xì)胞中獲得iPS細(xì)胞。利用免疫組化和RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)多潛能特異性標(biāo)志基因Oct4、Nanog、SSEA1、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，結(jié)果與其他動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的iPS細(xì)胞類似。本研究為將來(lái)利用iPS細(xì)胞治療馬的疾病開(kāi)拓了新途徑。

3　豬研究中應(yīng)用

豬是一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，對(duì)保障人類肉食品安全供應(yīng)有重要作用。因此利用基因工程技術(shù)提高其生產(chǎn)力、增強(qiáng)抗病力具有重要意義的。Clark等［15］利用PB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，與無(wú)轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入方法相比較，PB轉(zhuǎn)座子可使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆數(shù)提高28倍。Clark等借助PB轉(zhuǎn)座子也成功獲得了轉(zhuǎn)基因豬。Zhenfang Wu等［16］用轉(zhuǎn)座子載體pB-CMV-neo-EGFP和轉(zhuǎn)座酶載體mPBase共轉(zhuǎn)染豬胎兒產(chǎn)纖維細(xì)胞，通過(guò)G418篩選得到表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，隨后用SCNT技術(shù)獲得了表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因豬后代。Zicong Li等［17］利用細(xì)胞質(zhì)注射方法 （Cytoplasmic Injection，CTI），將PB轉(zhuǎn)座子載體pmGENIE-3-EGFP注射入豬胚胎細(xì)胞質(zhì)中，也獲得了表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因仔豬。證明PB轉(zhuǎn)座子是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的一種有效工具。

4　絨山羊研究中應(yīng)用

絨山羊主要飼養(yǎng)在生態(tài)脆弱的地區(qū)，減少飼養(yǎng)數(shù)量、提高產(chǎn)絨量一直是絨山羊育種的主要方向。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)是提高絨山羊產(chǎn)絨量和羊絨品質(zhì)的重要手段之一。何曉琳等［18］從陜北白絨山羊皮膚中克隆獲得FGF5s基因，構(gòu)建了表達(dá)FGF5s基因的PB轉(zhuǎn)座子載體，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)FGF5s基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。白丁平等［19］利用反向PCR在絨山羊基因組中檢測(cè)到21個(gè)整合位點(diǎn)，整合位點(diǎn)TTAA毗鄰一側(cè)的5個(gè)堿基組成中，3′傾向于整合到富含AT（58.35%）堿基區(qū)，5′傾向于整合到富含GC（57.8%）堿基區(qū)。以上研究可為PB轉(zhuǎn)座子在絨山羊基因工程中應(yīng)用提供理論參考。

5　家禽研究中應(yīng)用

PB轉(zhuǎn)座子在家禽中也開(kāi)展了一系列有意義的探索。新城疫病毒是一類養(yǎng)禽業(yè)危害極大的接觸性傳染病。唐文雅等［20］構(gòu)建了新城疫病毒V基因PB轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTKL1-CMV-Puro-EGFP，與輔助質(zhì)粒mPB共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1），獲得了穩(wěn)定表達(dá)新城疫病毒V蛋白的DF-1細(xì)胞系。為PB轉(zhuǎn)座子在家禽細(xì)胞中的應(yīng)用提供了參考。維甲酸誘導(dǎo)基因-I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）通過(guò)特異識(shí)別并結(jié)合病毒RNA而發(fā)揮抗病毒作用。鴨和鵝體內(nèi)含有RIG-I受體，而雞體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)RIG-I受體。胡躍等［21］借助PB轉(zhuǎn)座子將鵝的RIG-I轉(zhuǎn)染到DF-1中，獲得了穩(wěn)定表達(dá)鵝RIG-I的DF-1細(xì)胞系。獲得的表達(dá)RIG-I基因細(xì)胞系可用于研究雞先天性免疫機(jī)制。

利用PB轉(zhuǎn)座子也獲得了轉(zhuǎn)基因雞。Liu Xiaojuan等［22］利用顯微注射法將轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒ZGl-neo和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒CAG-PBase按3:1比例顯微注射到雞胚的胚盤(pán)下腔，經(jīng)電融合獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，隨后用二次換蛋殼法制備獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體。檢測(cè)10羽雄性轉(zhuǎn)基因個(gè)體時(shí)發(fā)現(xiàn)，40%的雄雞精液呈轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，表達(dá)GFP標(biāo)記基因。Jordan B J等［23］檢測(cè)利用PB轉(zhuǎn)座子獲得的轉(zhuǎn)GFP基因雞時(shí)發(fā)現(xiàn)，在雞的心臟、腦、肝、腸、腎和性腺等組織中GFP均穩(wěn)定表達(dá)。Park TS等［24］用表達(dá) GFP的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染雞原始生殖細(xì)胞（primordial germ-cell，PGC），經(jīng)G418篩選獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。隨后將受體雞蛋開(kāi)一小孔，利用顯微注射法將超過(guò)1 000個(gè)攜帶GFP的PGC注入到受體胚胎背主動(dòng)脈中，然后用石蠟封閉蛋殼，按常規(guī)方法對(duì)受體雞蛋進(jìn)行孵化，也獲得表達(dá)GFP轉(zhuǎn)基因雞后代。

6　總結(jié)與展望

PB轉(zhuǎn)座子作為一種非病毒基因工程載體，無(wú)潛在的遺傳毒性，在遺傳操作中相對(duì)安全。利用PB轉(zhuǎn)座子高效整合外源基因和轉(zhuǎn)座能力，可攜帶外源基因?qū)?dòng)物疾病進(jìn)行靶向治療。PB轉(zhuǎn)座子同時(shí)也是一種高效的基因誘變工具，利用它使目標(biāo)基因誘變失活，從而確定該基因功能?？傊?，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用PB轉(zhuǎn)座子對(duì)推動(dòng)畜禽基因組功能研究、疾病治療，培育家畜和家禽新品種等方面具有重要意義。

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Research development of piggyBac transposon in animal husbandry and veterinary science

Lin Limei1Zhou Shiye2Bai Dingping1*
（1.College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002；2.Gene Pool of Waterfowl Resources，Shishi Fujian 362700）

The non-viral piggybac（PB）transposon system has proven to be an effective tool of research with genetic manipulation and transgenic animal.Transgenic animals of mice，chickens，pig，and goat have obtained by PB transposon.The current review focused on the application of PB transposon in animal husbandry and veterinary sciences.

piggyback transposon genetic engineering transgenic animal

A

1003-4331（2016）04-0029-03

福建省教育廳中青年教育科研項(xiàng)目（JA13109）、福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01076）資助。

林麗梅（1994-），女，本科生，動(dòng)物科學(xué)專業(yè)。E-mail:1009174137@qq.com。
*

白丁平（1976-），男，講師，博士。研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail:bdpnx@163.com。