張永香　陳海南　陳樨　張如梅（.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司35004；.湖北省襄陽市襄州區(qū)畜牧獸醫(yī)局4404）

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豬流行性腹瀉病毒的分子生物學(xué)特性以及胰酶對其作用機(jī)理

張永香1陳海南2陳樨1張如梅1
（1.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司350014；2.湖北省襄陽市襄州區(qū)畜牧獸醫(yī)局441104）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）在體外分離培養(yǎng)需依賴胰酶，目前胰酶對豬流行性腹瀉病毒的作用機(jī)理尚未完全清晰，文中從分子生物學(xué)方面闡述胰酶對豬流行性腹瀉病毒的作用。

豬流行性腹瀉病毒分子生物學(xué)胰酶

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的高度接觸性腸道傳染性疾病。臨床上以引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水等為主要特征。該病一年四季均可發(fā)生，但以每年的冬、春季節(jié)為發(fā)病高峰期。傳播途徑主要通過消化道傳播，即糞-口傳播，無需傳播媒介。豬群一旦感染病毒可持續(xù)存在，各個年齡段的豬均易感，但以哺乳仔豬的發(fā)病率和病死率最為嚴(yán)重，且耐過的仔豬也易成“僵豬”［1-2］。由于當(dāng)前缺乏有效的治療和防控措施，使其成為業(yè)界持續(xù)關(guān)注的焦點。

1　PEDV的病原學(xué)特性

PEDV屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬的成員，與其他冠狀病毒成員一樣，該病毒粒子的形態(tài)特征呈多形性，外有囊膜，囊膜上有花瓣狀纖突。病毒在4℃、pH 5.0～9.0以及37℃、pH 6.5～7.5時穩(wěn)定［1］。豬的胃內(nèi)pH 4左右，腸道pH值較穩(wěn)定，從十二指腸pH 7.5到結(jié)腸pH 6.5呈逐漸衰減。小腸是病毒感染宿主的主要靶器官，而病毒是如何抵抗胃酸和蛋白酶的水解作用而保持侵染活性進(jìn)入小腸的，至今尚未見明確報道，推測病毒在37℃條件下可能具更強(qiáng)的耐酸堿能力。目前PEDV只有一個血清型，無凝集紅細(xì)胞的特性，但經(jīng)胰酶處理后可凝集兔的紅細(xì)胞，使病毒具血凝性［3］。

2　PEDV分子生物學(xué)特性

2.1基因組結(jié)構(gòu)PEDV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其核酸具感染性，大小為28～30 kb。基因組5'端有一個帽子結(jié)構(gòu)（cap），3'端有一個Poly（A）尾，其從5'→3'依次為5'-UTR-ORF1-S-ORF3-sM-M-N-3'-UTR。與其他冠狀病毒相比，該病毒的ORF1基因與S基因之間無其他基因，推測缺乏的可能就是冠狀病毒編碼相關(guān)血細(xì)胞凝集酶的基因［4］，所以，PEDV不具血凝性。

2.2基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能ORF1基因編碼的是一種非結(jié)構(gòu)的復(fù)制酶蛋白（Rep），該蛋白在病毒早期侵入宿主細(xì)胞發(fā)揮著極為重要的作用。而ORF3基因編碼的是一個功能未知的多態(tài)性非結(jié)構(gòu)蛋白，通過ORF3基因序列比對，發(fā)現(xiàn)野毒株、弱毒株之間存在基因缺失現(xiàn)象，而缺失的基因可作為病毒強(qiáng)弱毒株的鑒定，同時ORF3蛋白的表達(dá)還被認(rèn)為與病毒毒力有關(guān)［5-6］。

2.3基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能S基因編碼的S蛋白（纖突蛋白）是一種病毒粒子表面的糖蛋白，該蛋白可識別靶細(xì)胞，促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜的融合達(dá)到介導(dǎo)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的作用。同時在疫苗的免疫反應(yīng)中也起著重要的作用，還可介導(dǎo)機(jī)體中和抗體的產(chǎn)生［6-7］。sM基因（E基因）編碼E蛋白（小膜蛋白），M基因編碼M蛋白，都在病毒的自我組裝和出芽過程中起重要的作用；其中M蛋白還能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ɑ-干擾素，而且在補(bǔ)體存在時還可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生［8］。M蛋白和E蛋白可以形成具有干擾源活性的類似病毒粒子樣的偽顆粒［9］。N基因編碼N蛋白，主要形成核衣殼，在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制中起作用。

3　胰酶的作用機(jī)理

3.1胰酶作用于病毒的機(jī)理冠狀病毒是囊膜病毒，進(jìn)入宿主細(xì)胞主要有兩種途徑，即細(xì)胞膜與病毒囊膜的融合和細(xì)胞的胞吞。而冠狀病毒一般是通過S蛋白的融合而進(jìn)入宿主細(xì)胞的［10］。PEDV的早期分離需依賴胰酶，目前胰酶對PEDV的作用機(jī)理尚未完全清晰，但它在病毒進(jìn)入細(xì)胞和釋放出細(xì)胞的過程中都發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)病毒在體外培養(yǎng)時，一旦與受體結(jié)合后，其S蛋白需借助外源蛋白酶（胰酶）改變其構(gòu)象（將S蛋白切割成S1區(qū)域和S2區(qū)域），促進(jìn)病毒與細(xì)胞發(fā)生融合。其中切割成的S1區(qū)位于蛋白的表面，主要與宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合；而S2區(qū)位于病毒內(nèi)部，能介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的融合［7］；而在胰酶缺失時，PEDV與受體結(jié)合后可利用酸性環(huán)境激活S蛋白使其融合［10］。當(dāng)病毒與細(xì)胞發(fā)生融合后才會介導(dǎo)核衣殼穿入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，同時S蛋白繼續(xù)留在細(xì)胞膜表面，以介導(dǎo)細(xì)胞與相鄰細(xì)胞之間的融合，形成多核體，正是這種多核體細(xì)胞的形成才有利于病毒的復(fù)制。當(dāng)病毒完成復(fù)制后還需借助胰酶作用才能釋放出來，進(jìn)而感染鄰近的細(xì)胞［11］。所以，胰酶的作用主要是作用于病毒本身，幫助病毒的穿入與釋放。也有學(xué)者提出胰酶對PEDV的切割作用，僅針對粘附在宿主細(xì)胞表面的病毒起作用，并非是病毒感染細(xì)胞所必需的。

3.2胰酶作用于細(xì)胞的機(jī)理胰酶在細(xì)胞分散消化過程中主要是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，達(dá)到細(xì)胞相互離散的效果。冠狀病毒感染宿主細(xì)胞主要通過細(xì)胞間的融合，形成易于觀察的合胞體，但PEDV感染宿主細(xì)胞卻需借助外源蛋白（胰酶）的作用才可觀察到合胞體［10-11］。由于Vero細(xì)胞可抵抗較高濃度胰酶的作用，因此，該細(xì)胞常用于PEDV的分離培養(yǎng)。并且隨著胰酶濃度增加，病毒感染Vero細(xì)胞的效果就越明顯［10］。同時胰酶還能增強(qiáng)病毒對Vero細(xì)胞的感染力。經(jīng)胰酶處理后的病毒可使細(xì)胞間發(fā)生融合，形成合胞體和細(xì)胞空泡化［3］，因此，胰酶不僅作用于病毒本身還可作用于靶細(xì)胞；有文獻(xiàn)還指出胰酶能破壞干擾素，使病毒更易侵染宿主細(xì)胞［12］。因此，胰酶可促進(jìn)病毒感染細(xì)胞和增加病毒的滴度。

4　小結(jié)

胰酶是PEDV早期體外分離培養(yǎng)所必需的，胰酶在病毒感染細(xì)胞、細(xì)胞間的融合以及病毒的釋放過程中都起著重要的作用。因此，胰酶不僅可以作用于病毒還可作用于細(xì)胞。病毒經(jīng)繼代后可在不依賴外源蛋白（胰酶）的培養(yǎng)液中也能感染宿主細(xì)胞，但被胰酶“馴化”的病毒（商品化弱毒疫苗）經(jīng)基因測序發(fā)現(xiàn)，其S基因上存在堿基或氨基酸突變現(xiàn)象，而M基因和N基因卻無明顯突變［13］，這可能是導(dǎo)致目前商品化疫苗免疫效果不佳的原因。

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M olecular biological characteristics of porcine epidem ic diarrhea virus and itsmechanism of trypsin

Zhang Yongxiang1Chen Hainan2Chen Xi1Zhang Rumei1
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，F(xiàn)uzhou 350014；2.Xiangzhou District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Xiangyang City，Hubei 441104）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）isolated in vitro rely on trypsin，the currentmechanism of action of trypsin on porcine epidemic diarrhea virus has not yet fully clear，this paper from the molecular biology of trypsin porcine epidemic diarrhea virus effect.

Porcine epidemic diarrhea virus Molecular biology Trypsin

A

1003-4331（2016）03-0031-02

福建省科技重大專項（2013Y31010019）資助。

張永香（1985-），女。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生，臨床獸醫(yī)學(xué)專業(yè)，zyxvet@163.com。