徐紅霞,蔣媛媛,洪雅雯,應(yīng)鐵進(jìn)

(浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系,浙江杭州 310058)

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野生枝瑚菌多糖的提取及單糖組成分析

徐紅霞,蔣媛媛,洪雅雯,應(yīng)鐵進(jìn)*

(浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系,浙江杭州 310058)

為探索野生枝瑚菌多糖水浸提的最佳條件,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化野生枝瑚菌多糖的提取條件,并采用柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定野生枝瑚菌多糖的單糖組成。根據(jù)回歸分析得到野生枝瑚菌粗多糖的最佳提取條件為溫度91 ℃,水料比32∶1(mL/g),時(shí)間3.2 h,在此條件下野生枝瑚菌多糖得率為1.97%。高效液相色譜分析結(jié)果表明枝瑚菌多糖由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖六種單糖組成,各組分摩爾比為:45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,響應(yīng)面法對(duì)野生枝瑚菌多糖的提取條件優(yōu)化合理可行,PMP-HPLC法,可用于測(cè)定野生枝瑚菌多糖中單糖的組成。

響應(yīng)面分析法,野生枝瑚菌多糖,提取工藝,單糖組成

食用菌多糖是食用菌子實(shí)體,或菌絲中存在的一類活性多糖,具有廣泛的藥理活性[1]和保健作用。食用菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能、降血脂等生物活性[2],具有很好的研究與開發(fā)價(jià)值。

野生枝瑚菌(Ramariasp.)又名掃帚菌,刷把菌,屬于非褶菌目,枝瑚菌科,枝瑚菌屬,是一種常見的真菌科類,子實(shí)體中等大小,多分枝形成稠密的細(xì)枝,呈珊瑚狀,夏秋季在山區(qū)云杉等針葉林中地上的落葉層或枯枝,落果上群生,往往密集在一起,該科各屬含有很多別具風(fēng)味的食用菌,是我國野生食用菌資源中寶貴的組成部分[3]。據(jù)報(bào)導(dǎo)部分枝瑚菌對(duì)小白鼠肉瘤(S-180)和艾氏癌(EC)有較強(qiáng)抑制作用[4],所以該類真菌很有研究?jī)r(jià)值。目前國內(nèi)外對(duì)枝瑚菌多糖提取工藝的研究報(bào)道較少[5-6],而且未見關(guān)于枝瑚菌多糖單糖組成的報(bào)道。本研究以采自貴州的野生枝瑚菌為原料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以多糖得率為指標(biāo)研究枝瑚菌多糖的最佳提取工藝,并采用柱前衍生高效液相色譜法測(cè)其單糖組成。為今后進(jìn)一步研究和開發(fā)野生枝瑚菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生枝瑚菌鮮品購于貴州婷婷野生食用菌批發(fā)中心,晾干備用；葡萄糖,無水乙醇,濃硫酸,苯酚,三氯甲烷,正丁醇,三氟乙酸,1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP),氫氧化鈉,鹽酸 均為分析純；乙腈 色譜純,單糖標(biāo)品購自sigma公司。

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 普析通用;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵 杭州明遠(yuǎn)儀器有限公司;HH-S電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;飛利浦?jǐn)嚢铏C(jī) 飛利浦家庭電器有限公司;高效液相色譜儀LC-20AD 日本島津。

1.2 提取方法及純化

野生枝瑚菌干品→去雜,洗凈→50 ℃烘干至恒重→熱水浸提→離心抽濾,收集水提液→減壓濃縮→加入三倍體積無水乙醇4 ℃醇沉過夜→離心收集沉淀→低溫烘干得多糖粗提物[7]

將粗提物溶于水,經(jīng)sevage法除蛋白,AB-8大孔吸附樹脂脫色,透析后冷凍干燥,用于單糖組成分析。

1.3 多糖含量測(cè)定

多糖含量的測(cè)量方法選用苯酚-硫酸法[8-10]。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

多糖得率(%)=(m/M)×100

注:m-多糖粗提物質(zhì)量;M-樣品質(zhì)量。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)在水料比20∶1 (mL/g),提取時(shí)間2 h,提取一次的前提下,提取溫度分別選60、70、80、90、100 ℃這五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn);在提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間2 h,提取一次的前提下,水料比分別選10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)這五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn);在提取溫度為80 ℃,水料比20∶1,提取一次的前提下,提取時(shí)間分別選1、2、3、4、5 h這五個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn);在提取溫度為80 ℃,在水料比20∶1 (mL/g),提取時(shí)間2 h的前提下,以上一次提取多糖后的殘?jiān)鼮樵线M(jìn)行提取,分別計(jì)算提取一次、提取兩次、提取三次、提取四次多糖的得率。每組平行三次,計(jì)算野生枝瑚菌多糖得率。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

[11-13]的方法,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過Design-Expert8.0.6軟件,采用Box-benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用三因素三水平響應(yīng)面分析法,以確定最優(yōu)提取工藝,響應(yīng)值Y為多糖得率(%)。

因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平編碼表Table 1 Experiment factors,level and code

1.6 野生枝瑚菌多糖的單糖組成分析

衍生物的制備[14-15]:稱取5 mg多糖于具塞試管,加2 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA),混勻封管,110 ℃水解4 h。減壓蒸干,再加甲醇3 mL蒸干,重復(fù)三次,除盡TFA,加0.5 mL水溶解,離心,取100 μL上清液于離心管,加入100 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液,100 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉混合均勻,然后70 ℃水浴30 min,取出冷卻,加入100 μL 0.3 mol/L的鹽酸中和,加1 mL水和1 mL氯仿萃取,棄去氯仿層,共萃取3次,上清液過0.45 μm濾膜轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶備用。

衍生物的液相色譜條件:紫外檢測(cè)器 250 nm,流速 1.0 mol/min,柱溫 25 ℃,進(jìn)樣體積10 μL,運(yùn)行時(shí)間35 min。

流動(dòng)相A:15%乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH6.9)

流動(dòng)相B:40%乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH,pH6.9)

梯度模式:時(shí)間梯度0→10→25→30 min,對(duì)應(yīng)溶劑B質(zhì)量濃度梯度0→18%→25%→30%。

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)單糖:葡糖糖(Glu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)做同樣處理。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并用Origin8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 由圖1可以看出,在60～90 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高多糖的得率逐漸增加,當(dāng)溫度超過90 ℃后,多糖的得率開始下降。這主要是由于在高溫作用下,水溶性多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞,造成多糖得率下降。因此適宜的提取溫度為90 ℃左右。

圖1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides

2.1.2 水料比對(duì)多糖得率的影響 由圖2可知,在一定范圍內(nèi),多糖得率隨水料比的升高而逐漸增多,而當(dāng)水料比超過30∶1 (mL/g)時(shí)多糖的得率開始下降,水料比太小物料無法充分溶解導(dǎo)致得率偏低,水量多些有利于多糖的擴(kuò)散傳質(zhì),但水量過多也會(huì)增加后續(xù)蒸發(fā)濃縮時(shí)間,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知水料比30∶1 (mL/g)較為合適。

圖2 水料比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of ratios of water to materials on extraction yield of polysacchariedes

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖3可知,多糖得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,到3 h到達(dá)最大值隨后開始下降,因此提取時(shí)間在3 h左右為宜。時(shí)間過短多糖溶解不充分未被充分提取,時(shí)間過長(zhǎng)又容易引起多糖降解及結(jié)構(gòu)的變化,甚至使其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)裂解而轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苡谝掖嫉膯翁?、寡糖或低聚?在醇沉過程中有所損失,最終會(huì)導(dǎo)致多糖得率的下降[16]。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of polysacchariedes

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響 由圖4可以看出提取一次就可以把大部分的多糖提取出來,而且增加提取次數(shù)不但耗能而且耗時(shí),從節(jié)能省耗、減少操作工序考慮提取一次即可。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of the extract times on the yield of polysaccharides

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

采用Design-Expert軟件,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2,分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果Table 2 RSM design and polysaccharides yield

注:共有15個(gè)實(shí)驗(yàn),其中1～12為析因?qū)嶒?yàn),13～15為中心實(shí)驗(yàn),用以估計(jì)誤差。

三個(gè)因子經(jīng)過擬合得到的回歸方程為:Y(%)=1.92+0.041X1+0.054X2+0.069X3-0.034X1X2+1.15×10-3X1X3+2.575×10-3X2X3-0.23X12-0.14X22-0.13X32

將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平,得到另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.1 溫度和水料比對(duì)多糖得率的影響 圖5是溫度和水料比交互作用對(duì)多糖得率的影響。由圖可知溫度和水料比兩者的交互作用比較明顯,當(dāng)溫度不變時(shí),野生枝瑚菌多糖的得率隨著水料比的增大表現(xiàn)為先上升后下降,當(dāng)水料比不變時(shí),多糖得率隨溫度的升高表現(xiàn)為先上升后下降。從圖中響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出在所選范圍內(nèi)存在極值,既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)。

圖5 浸提溫度、水料比及其交互作用 對(duì)多糖得率的影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface diagram and contour plot of extraction temperature and extraction time on Y

2.2.2 溫度和時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 圖6可以看出當(dāng)水料比為20∶1(mL/g)時(shí),隨著時(shí)間的增加多糖得率也逐漸增大,而后稍有下降,隨著溫度的升高多糖得率先增加后下降,多糖得率的變化速率顯示時(shí)間的效應(yīng)大于溫度。提取溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致一些大分子多糖降解。

圖6 浸提溫度和時(shí)間對(duì)多糖得率的影響響應(yīng)面和等值線圖Fig.6 Response surface diagram and contour plot of extraction temperature and extraction time on Y

2.2.3 水料比和時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 由圖7可以看出,相對(duì)于水料比,浸提時(shí)間對(duì)野生枝瑚菌多糖得率的影響較為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡,等高線密集,隨著水料比的增加多糖得率先增加后減小,水料比適宜細(xì)胞升溫快,細(xì)胞壁能較快破裂,多糖得率高,隨著液料比增加細(xì)胞升溫緩慢,破壁效應(yīng)減小,多糖得率降低。因此提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)水料比不宜過大。

圖7 水料比和時(shí)間對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等值線圖Fig.7 Response surface diagram and contour plot of water to materials ratio and extraction time on Y

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定 由Design-Expert 8.0.6軟件分析得到最大響應(yīng)值(Y)時(shí),X1,X2,X3對(duì)應(yīng)的編碼值分別為0.08,0.19,0.27。與其對(duì)應(yīng)的野生枝瑚菌粗多糖的最佳提取條件為提取溫度90.8 ℃,水料比31.9∶1(mL/g),提取時(shí)間3.27 h,在此條件下野生枝瑚菌粗多糖得率的理論值為1.9358%,為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳提取條件進(jìn)行野生枝瑚菌粗多糖提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到實(shí)際可操作性,將優(yōu)化參數(shù)設(shè)置為提取溫度91 ℃,水料比32∶1(mL/g),提取時(shí)間3.2 h。

采用上述優(yōu)化參數(shù)提取野生枝瑚菌多糖,測(cè)得3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為1.9663%,與理論值相差0.031%,相差不大。因此響應(yīng)面法優(yōu)化得到的野生枝瑚菌粗多糖的提取工藝參數(shù)是可行的。

2.3 野生枝瑚菌多糖的單糖組成分析

經(jīng)柱前衍生化高效液相色譜分析得到野生枝瑚菌多糖由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖六種單糖組成,各組分摩爾比為:45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24。野生枝瑚菌多糖主要由甘露糖和葡萄糖兩種單糖組成。

圖8 7種單糖標(biāo)品混合物的高效液相色譜圖Fig.8 The HPLC chromatograms of mixture of seven standard monosaccharide注：1.甘露糖；2.核糖；3.鼠李糖；4.葡萄糖； 5.半乳糖；6.木糖；7.巖藻糖，圖9同。

圖9 枝瑚菌多糖高效液相色譜圖Fig.9 The HPLC chromatograms of Ramaria mushroom polysaccharide

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以及在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過三因素三水平響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn),應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件,采用Box-Behnken Design建立野生枝瑚菌多糖提取的數(shù)學(xué)模型為:Y(%)=1.92+0.041X1+0.054X2+0.069X3-0.034X1X2+1.15×10-3X1X3+2.57510-3X2X3-0.23X12-0.14X22-0.13X32;提取工藝的優(yōu)化參數(shù)為提取溫度91 ℃,水料比32∶1(mL/g),提取時(shí)間3.2 h。按此條件提取野生枝瑚菌多糖得率為1.97%,與理論值相對(duì)誤差僅1.58%,說明建立的模型能很好的預(yù)測(cè)各因素與多糖得率之間的關(guān)系,響應(yīng)面分析法優(yōu)化野生枝瑚菌多糖的提取工藝是可行的。

運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)野生枝瑚菌多糖的單糖組分進(jìn)行分析表明,枝瑚菌多糖由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖六種單糖組成,各組分摩爾比為:45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24。

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Extraction and analysis of monosaccharide compositions of wildRamariasp. polysaccharide

XU Hong-xia,JIANG Yuan-yuan,HONG Ya-wen,YING Tie-jin*

(Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

TooptimizetheextractionconditionsforthepolysaccharidesfromRamariasp.,basedonthesinglefactortrials,theresponsesurfacemethodologywereapplied.Usingthehighperformanceliquidchromatographyforthedeterminationofthemonosaccharidecomposition.Theresultsshowedthattheoptimumextractionconditionswasasfollows:temperature91 ℃,water-to-material-ratio32∶1(mL/g),time3.2h.Undertheseconditions,theactualextactionratewas1.97%.ThePMP-HPLCresultsshowedthattheRamariasp.polysaccharideswascomposedofmannose,ribose,glucose,galatose,xylose,andfucoseandtheirmolarratiowasabout45.8∶10.6∶76.4∶8.53∶4.63∶5.24.Conclusion:TheRSMmethodcouldbeusedforoptimizingtheextractionconditionofRamariasp.polysaccharidesandthePMP-HPLCmethodcouldbeusedfordeterminationofpolysaccharidecompositions.

surfaceresponsemethodology;wildRamariasp.polysaccharide;extractiontechnique;momosaccharidecomposition

2016-05-30

徐紅霞(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分，E-mail:hongxiaxu35@163.com。

*通訊作者:應(yīng)鐵進(jìn)(1958-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品采后生理和儲(chǔ)運(yùn)保鮮，E-mail:tjying@zju.edu.cn。

浙江大學(xué)馥莉食品研究院資助項(xiàng)目(KY201405)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)21-0255-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.040