耿敬章

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000)

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柳葉臘梅葉總黃酮超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取及抗氧化活性研究

耿敬章

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723000)

以柳葉臘梅葉為原料,研究復(fù)合酶協(xié)同超聲波提取柳葉臘梅葉總黃酮的提取工藝及體外抗氧化活性。以柳葉臘梅葉總黃酮的提取量為指標(biāo),確定了最佳處理酶為纖維素酶和果膠酶復(fù)合添加,添加比例為3∶1。并通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗確定柳葉臘梅葉總黃酮提取最佳工藝條件為超聲功率290 W,超聲提取時間24 min,乙醇濃度90%,液料比27(mL/g)。在此條件下進行驗證實驗,柳葉臘梅葉總黃酮的提取量達到83.1 mg/g。抗氧化實驗表明柳葉臘梅葉總黃酮的自由基清除效果為IC50(DPPH·)=1.22 mg/mL,IC50(·OH)=0.92 mg/mL,因此,柳葉臘梅葉總黃酮具有較好的體外抗氧化活性。

柳葉臘梅葉,總黃酮,提取,復(fù)合酶,抗氧化

柳葉蠟梅(ChimonanthussalicifoliusS.Y.H)為蠟梅科蠟梅屬植物[1],俗稱石涼茶、山蠟茶等,是優(yōu)良的香料植物和藥用植物,為畬族廣泛應(yīng)用的中草藥之一[2-3],并且國家衛(wèi)生計生委已經(jīng)批準(zhǔn)柳葉蠟梅作為新食品原料開發(fā)利用[4]。現(xiàn)代藥理研究表明,山臘梅茶對抗菌消炎、抗病毒效果顯著[5]。研究表明,柳葉蠟梅富含揮發(fā)油、槲皮素、黃酮類、生物堿等有效活性成份,具有清熱解毒、預(yù)防感冒、助消化、止瀉、減肥、消脂降壓、預(yù)防心腦血管疾病的作用[6-8]。其中黃酮類化合物是柳葉臘梅葉中最主要的功能性成分[9]。黃酮類化合物是一類具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖以及增強免疫力等功效的生物活性的物質(zhì)總稱,目前,黃酮類化合物提取方法以乙醇浸提法和超聲波、微波輔助提取法[10-11]為主,而復(fù)合酶協(xié)同超聲提取柳葉臘梅葉總黃酮仍未見報道。因此,本實驗選取柳葉臘梅葉為原料,優(yōu)化復(fù)合酶協(xié)同超聲提取柳葉臘梅葉總黃酮的工藝條件,并研究其體外抗氧化活性,以期為柳葉臘梅的開發(fā)利用提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

柳葉臘梅葉 采集于陜南植物園,洗凈后60 ℃烘干,粉碎。過60～80目篩,備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所,純度99.7%;纖維素酶(酶活力10000 U/g)、果膠酶(酶活力 30000～100000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力10000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力10000 U/g)、堿性蛋白酶(酶活力10000 U/g) 和氏璧生物技術(shù)有限公司;VC、乙醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3等,所有試劑均為分析純,天津市富宇精細化工有限公司;HPD-600型大孔樹脂 鄭州勤實科技有限公司。

ZN-02型粉粹機 北京興時利和科技有限公司;TU-1221紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器公司;QCD6150型數(shù)控超聲清洗器 天津恒瑞機電設(shè)備有限公司;TDL-40B型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;Al204型電子天平 梅特勒-托利多儀器 上海有限公司;DHF-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;RE5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠 等。

1.2 實驗方法

1.2.1 柳葉臘梅葉總黃酮提取工藝流程 柳葉臘梅葉→稱取→調(diào)pH→酶解→滅酶→超聲輔助提取→真空抽濾→收集濾液→濾渣再提取→合并濾液→減壓濃縮→石油醚脫脂→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→柳葉臘梅葉總黃酮粗提物→大孔樹脂柱→吸附→洗脫→收集→濃縮→加乙醇→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→真空干燥→柳葉臘梅葉總黃酮純品

1.2.2 柳葉臘梅葉總黃酮的測定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[12]。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg置于10 mL容量瓶中,95%乙醇溶解后稀釋到100 mL。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.8、1.6、2.2、3.5、5.0、10.0 mL于6只100 mL容量瓶中,加入2.0 mL 5% NaNO2溶液,放置3 min,加2.0 mL 10% Al(NO3)3溶液,放置3 min,最后加10.0 mL 4% NaOH溶液。蒸餾水定容,搖勻。以不加顯色劑的空白組作對比,510 nm處測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測定:準(zhǔn)確移取一定量的樣品溶液于容量瓶中,加入顯色劑,定容,搖勻。以不加顯色劑的空白組作對比,510 nm處測樣品吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到不同處理的總黃酮的含量,并按下式計算柳葉臘梅葉總黃酮的提取量。

其中,M為柳葉臘梅葉總黃酮的提取量(mg/g);M1為不同處理所得的總黃酮的含量(mg);M0為不同處理所用柳葉蠟梅原料質(zhì)量(g)。

1.2.3 酶種類的選擇 參考有關(guān)文獻[13],分別選取纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶,添加量為柳葉蠟梅質(zhì)量的2%,于42 ℃的恒溫水浴鍋中酶解90min,然后煮沸滅酶10min,在乙醇濃度為80%、超聲功率為300W、液料比為15(g/mL)的條件下提取20min。以柳葉臘梅葉總黃酮提取量為指標(biāo),篩選出適合柳葉臘梅葉總黃酮提取的酶種類。

1.2.4 復(fù)合酶添加比例的確定 纖維素酶和果膠酶分別按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(g/g)比例添加,添加柳葉蠟梅質(zhì)量2%,其他同1.2.3操作。

1.2.5 柳葉臘梅葉總黃酮提取條件的優(yōu)化 通過單因素實驗考察乙醇濃度、超聲功率、超聲提取時間、液料比對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響,在選取各因素的最優(yōu)實驗范圍,采用響應(yīng)面優(yōu)化法對柳葉臘梅葉總黃酮超聲提取條件進行優(yōu)化。

1.2.5.1 超聲功率對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 設(shè)定超聲提取時間20min,乙醇濃度為85%,液料比為21(g/mL),分別在超聲功率為150、200、250、300、350、400、450W七個梯度下提取柳葉臘梅葉總黃酮并且測其提取量。

1.2.5.2 超聲提取時間對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 設(shè)定超聲功率300W,乙醇濃度為85%,液料比為21(g/mL),分別在超聲提取時間為5、10、15、20、25、30、35min七個梯度下提取柳葉臘梅葉總黃酮并且測其提取量。

1.2.5.3 乙醇濃度對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 設(shè)定超聲功率為300W,超聲提取時間為20min,液料比為21(g/mL),分別在乙醇濃度為70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%七個梯度下提取柳葉臘梅葉總黃酮并且測其提取量。

1.2.5.4 液料比對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 設(shè)定超聲功率為300W,超聲提取時間為20min,乙醇濃度為85%,分別在液料比為12、15、18、21、24、27、30(mL/g)七個梯度下提取柳葉臘梅葉總黃酮并且測其提取量。

1.2.5.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 結(jié)合單因素實驗結(jié)果,選取超聲功率、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比,以總黃酮提取量為評價指標(biāo),采用響應(yīng)面實驗設(shè)計方案,優(yōu)化柳葉臘梅葉總黃酮超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取的工藝條件,因素水平見表1。

1.2.6 柳葉臘梅葉總黃酮抗氧化活性研究

1.2.6.1DPPH·清除率的測定 參考ShimadaK等[14]的方法。取柳葉臘梅葉黃酮溶液1.0mL與10mL100μmol/L的DPPH·溶液加入同一試管中,搖勻,黑暗中放置20min,測其吸光度,下列公式計算清除率:

清除率(%)=[(Ac-Ai)/Ac]×100

式中:Ac-去離子水加DPPH·溶液的吸光度;Ai-柳葉臘梅葉黃酮溶液加DPPH·溶液的吸光度。

1.2.6.2 羥自由基(·OH)清除能力的測定 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定[15]。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Test factors level and coding

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按1.2.2方法得到的510 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式經(jīng)統(tǒng)計回歸處理,得到線性方程為y=7.3673X-0.0179,R2=0.9998,x為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL);y為吸光度。

2.2 酶種類對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響

由圖1可知,當(dāng)選用單一酶時,柳葉臘梅葉總黃酮提取量較低,只選用纖維素酶時,總黃酮提取量為單一酶組最高為54.2 mg/g。然而,兩者酶復(fù)合使用時,總黃酮提取量提高,纖維素酶和果膠酶復(fù)合使用時,總黃酮提取量達到64.7 mg/g。這可能因為兩種酶彼此之間存在協(xié)同作用,提高了提取量。故提取柳葉臘梅葉總黃酮時,選擇纖維素酶和果膠酶復(fù)合使用。

圖1 酶種類對柳葉臘梅葉總黃酮提取量的影響Fig.1 Influence of types of enzyme on extraction rate of total flavonoids

2.3 酶添加比例對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響

由圖2可知,纖維素酶和果膠酶以3∶1(g/g)比例比添加時總黃酮提取量較高,故選擇纖維素酶和果膠酶的添加比例為3∶1(g/g)。

圖2 纖維素酶和果膠酶添加比例 對柳葉臘梅葉總黃酮提取量的影響Fig.2 Influence of addition ratio of cellulose and pectinase on extraction of total flavonoids

2.4 柳葉臘梅葉總黃酮提取條件的優(yōu)化

2.4.1 超聲功率對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 超聲波的空化作用能在液體內(nèi)部產(chǎn)生強烈的沖擊波和微射流,有助于細胞內(nèi)組分滲透到溶液中,由圖3可以看出,在150～300 W范圍內(nèi),柳葉臘梅葉總黃酮提取量隨著超聲功率的增加而隨之增大,當(dāng)超聲功率為300 W時提取量達到最大,因此最佳超聲功率應(yīng)該控制在300 W左右。

圖3 超聲功率對提取效果的影響Fig.3 Influence of ultrasonic frequency on extraction effect

2.4.2 超聲提取時間對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 由圖4可以看出,在5～20 min范圍內(nèi),柳葉臘梅葉總黃酮提取量隨著超聲時間的延長而隨之增大,當(dāng)超聲時間為20 min時提取量達到最大,繼續(xù)增加超聲處理時間,其黃酮提取量反而降低,分析造成此結(jié)果的可能原因是:長時間高溫超聲處理會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu),影響黃酮的得率。因此最佳提取時間應(yīng)該控制在20 min左右。

2.4.3 乙醇濃度對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 由圖5可以看出,在乙醇濃度70%～85%范圍內(nèi),隨著乙醇濃度的增大,柳葉臘梅葉總黃酮提取量逐漸增加,85%時達到最大,隨后隨著乙醇濃度的增大,柳葉臘梅葉總黃酮提取量逐漸降低。這是因不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液極性不同,黃酮類化合物具有較高的極性,85%乙醇水溶液極性與黃酮類化合物的極性相似,故選取乙醇濃度85%為宜。

圖5 乙醇濃度對提取效果影響Fig.5 Influence of ethanol concentration on extraction effect

2.4.4 液料比對柳葉臘梅葉總黃酮提取效果的影響 如圖6所示,在液料比12～24(g/mL)范圍內(nèi),柳葉臘梅葉總黃酮提取量隨著料液比的增大而增加,當(dāng)料液比達到24(mL/g)時,柳葉臘梅葉總黃酮提取量達到最大,之后隨著料液比增大,柳葉臘梅葉總黃酮提取量增加趨于平衡,同時,增大料液會增加溶劑的消耗以及影響提取液的濃縮過程,為節(jié)約試劑考慮,因此選擇液料比24(mL/g)為宜。

圖6 液料比對提取效果的影響Fig.6 Influence of solution to material ratio on extraction effect

2.4.5 柳葉臘梅葉總黃酮提取條件的優(yōu)化實驗 結(jié)果見表2。

表2 柳葉臘梅葉總黃酮提取實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Test design and results of total flavonoids from Chmonathus salicifolius S.Y.H leaves

關(guān)于柳葉臘梅葉總黃酮的提取量二次回歸擬合方程:

提取量(mg/g)=77.47+6.48A+10.38B+6.95C+0.42D+4.52AB+2.52AC+9.33A D-0.65BC+7.91BD+4.55CD-7.78A2-8.22B2-6.85C2-2.44D2(其中,A為超聲功率,B為超聲提取時間,C為乙醇濃度,D為液料比)。

由表3可以看出,模型的p值為<0.0001,而失擬項的p值為0.3078,說明了柳葉臘梅葉總黃酮提取的模型與實際情況擬合程度比較好,可以預(yù)測柳葉臘梅葉總黃酮提取的條件。對柳葉臘梅葉總黃酮提取進行分析,超聲功率、超聲提取時間、乙醇濃度、液料比都是顯著因素。

由方差分析結(jié)果可以看出,AB的交互作用、AC的交互作用、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作用、CD的交互作用都顯著,相應(yīng)曲面圖見圖7至圖12。

圖7 超聲波功率與超聲波提取時間交互作用 對提取量影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of influence of extraction power and extraction time interaction on extraction amount

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 The variance analysis of regression equation

圖8 超聲波功率與乙醇濃度作用 對提取量影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of influence of extraction power and ethanol concentration interaction on extraction amount

圖9 超聲波功率與液料比交互作用 對提取量影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface of influence of extraction power and solution to material ratio interaction on extraction amount

圖10 超聲波提取時間與乙醇濃度交互作用 對提取量影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface of influence of extraction time and ethanol concentration interaction on extraction amount

圖11 超聲波提取時間與液料比交互作用 對提取量影響的響應(yīng)面Fig.11 Response surface of influence of solution to material ratio material ratio interaction on extraction amount

圖12 乙醇濃度與液料比交互作用 對提取量影響的響應(yīng)面Fig.12 Response surface of influence of extraction time and ethanol concentration and solution to interaction on extraction amount

注:“Prob>F”<0.05,代表研究因素為顯著因素。根據(jù)柳葉臘梅葉總黃酮提取實驗結(jié)果和回歸方程各項的方差分析,由響應(yīng)面分析法優(yōu)化出柳葉臘梅葉總黃酮提取最佳工藝條件為超聲功率287.8 W,超聲提取時間24.4 min,乙醇濃度89.7%,液料比26.6(g/mL)。并考慮到實際操作的便利性,確定超聲功率290 W,超聲提取時間24 min,乙醇濃度90%,液料比27(g/mL)。在此條件下進行驗證實驗,三次平行實驗取平均值,柳葉臘梅葉總黃酮的提取量達到83.1 mg/g。

2.5 柳葉臘梅葉總黃酮體外抗氧化研究

2.5.1 柳葉臘梅葉總黃酮對DPPH·的清除能力的測定 DPPH·法操作簡單,反應(yīng)靈敏,目前已廣泛應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物或單一化合物的抗氧化能力評價[16]。由圖13可知,在實驗濃度范圍內(nèi),隨著柳葉臘梅葉總黃酮添加量的增加,DPPH·的清除率升高。在濃度小于1.4 mg/mL時,柳葉臘梅葉總黃酮對DPPH·的清除率明顯小于對照組VC,然而當(dāng)濃度大于1.4 mg/mL時,柳葉臘梅葉總黃酮對DPPH·的清除率與相同濃度的VC溶液清除能力逐漸接近。因此,柳葉臘梅葉總黃酮(IC50=1.22 mg/mL)具有較好的清除DPPH·的能力。

圖13 柳葉臘梅葉總黃酮對DPPH·的清除能力Fig.13 Scavenging activity of total flavonoids from Chmonathus salicifolius S.Y.H leaves to DPPH·

圖14 柳葉臘梅葉總黃酮對羥自由基(·OH)清除能力Fig.14 Scavenging activity of total flavonoids from Chmonathus salicifolius S.Y.H leaves to ·OH

2.5.2 柳葉臘梅葉總黃酮對羥自由基(·OH)清除能力的測定 ·OH是目前已知的最活潑的自由基,也是毒性最大的自由基[17]。由圖14可以看出,隨著濃度增大,柳葉臘梅葉總黃酮對·OH的清除能力逐漸增強。當(dāng)濃度小于1.2 mg/mL時,柳葉臘梅葉總黃酮清除·OH的能力小于對照組VC,當(dāng)柳葉臘梅葉總黃酮濃度在1～1.4 mg/mL時,柳葉臘梅葉總黃酮清除·OH的能力顯著提高,之后清除·OH的能力總是大于VC。當(dāng)柳葉臘梅葉總黃酮濃度為2.6 mg/mL,對·OH的最大清除率可達91.3%。這說明柳葉臘梅葉總黃酮(IC50=0.92 mg/mL)具有較強的清除·OH的能力。

3 結(jié)論

提取柳葉臘梅葉總黃酮最佳酶種類為纖維素酶和果膠酶復(fù)合添加,且按酶比例3∶1添加。提取柳葉臘梅葉總黃酮最佳工藝條件為超聲功率290 W,超聲提取時間24 min,乙醇濃度90%,液料比27(g/mL)。在此條件下進行驗證實驗,三次平行實驗取平均值,柳葉臘梅葉總黃酮的提取量達到83.1 mg/g。在柳葉臘梅葉黃酮提取過程中,各因素的交互作用對實驗結(jié)果有較大的影響。當(dāng)操作條件發(fā)生改變時,應(yīng)根據(jù)因素間的交互作用適當(dāng)調(diào)節(jié)其他因素,以保證有較好的提取效果。

考察了柳葉臘梅葉總黃酮的抗氧化活性,比較了柳葉臘梅葉總黃酮對DPPH·和·OH自由基的清除效果。結(jié)果表明,柳葉臘梅葉總黃酮具有良好的清除自由基能力,柳葉臘梅葉總黃酮的清除效果為IC50(DPPH·)=1.22 mg/mL,IC50(·OH)=0.92 mg/mL,因此,柳葉臘梅葉總黃酮具有較好的體外抗氧化活性,說明柳葉臘梅葉總黃酮的抗氧化能力不僅受黃酮的濃度的影響,而且還與自由基的種類有關(guān)。

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Extraction of total flavonoids fromChmonathussalicifoliusS.Y.H leaves by complex enzymatic hydrolysis assisted iltrasonic and its antioxidant activity

GENG Jing-zhang

(College of Biological Science and Engineering,Shaanxi SCI-TECH Universiiy,Hanzhong 723000,China)

TheextractionoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleavesbycomplexenzymatichydrolysisassistedultrasonicanditsantioxidantactivitywerestudied,theoptimumenzymeontheextractionamountoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleaveswerecelluloseandpectinase,andtheratioofcelluloseandpectinasewas3∶1.TheoptimumextractionconditionsoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleavesweredeterminedbyresponsesurfacemethodology.Itwasconcludedthatultrasonicextractionpowerfor290W,ultrasonicextractiontimefor24min,ethanolconcentrationfor90%,andthesolutionandmaterialratiofor27(mL/g).AndtheextractionamountoftotalflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleavesreached83.1mg/g.TheflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hleaveshadgoodantioxidantactivityin vitro,theoxidationexperimentsshowedthattheIC50ofDPPH·and·OHwere1.22mg/mLand0.92mg/mL,sotheflavonoidsfromChmonathus salicifoliusS.Y.Hhadgoodantioxidantactivity.

Chmonathus salicifoliusS.Y.Hleaves;totalflavonoids;extraction;compositeenzymatic;antioxidantactivity

2016-04-25

耿敬章(1980-)，男，碩士，副教授，研究方向：食品質(zhì)量控制與資源開發(fā)利用研究，E-mail:gengjingzhang@163.com。

陜西省社會發(fā)展攻關(guān)項目(2016SF-354)。

TS202

A

1002-0306(2016)21-0124-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.016