付 斌（齊齊哈爾市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站 黑龍江 齊齊哈爾 161000）

土壤中固氮菌的分離純化與性質(zhì)鑒定

付 斌（齊齊哈爾市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站 黑龍江 齊齊哈爾 161000）

采用阿斯貝培養(yǎng)基進(jìn)行菌種分離純化，再通過吲哚試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等9個(gè)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定，最終得到一株革蘭氏陰性，無芽孢的短桿狀固氮菌。試驗(yàn)為微生物固氮菌肥生產(chǎn)中菌種的篩選提供參考，為商業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物固氮菌肥提供基礎(chǔ)。

固氮菌；阿斯貝培養(yǎng)基；分離純化；鑒定

1 前言

氮是植物生長不可缺少的“維生素”，是合成蛋白質(zhì)的主要來源。在空氣中約有80%的氮?dú)庖杂坞x狀態(tài)存在，不能為生物體直接利用。而固氮菌能通過其體內(nèi)固氮酶的作用，把空氣中植物無法吸收的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨態(tài)氮固定下來，成為植物可以直接利用的氮肥。

固氮菌肥的作用效果和生態(tài)效益是化學(xué)肥料所不具備的。施用固氮菌肥，能有效的提高土壤的有效氮素，增加農(nóng)作物產(chǎn)量。固氮菌除能固氮之外，還能形成維生素和異生長素，不僅能夠刺激農(nóng)作物生長發(fā)育，還可以加強(qiáng)其他根際微生物的生命活動(dòng)，促進(jìn)土壤有機(jī)物質(zhì)的礦化作用，改良土壤結(jié)構(gòu)，改善農(nóng)作物品質(zhì)。加強(qiáng)土壤固氮菌的篩選、馴化、應(yīng)用研究，對(duì)于減少化肥的使用量，提高農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，改良土壤，改善環(huán)境具有重大意義。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

（1）菌株來源

本試驗(yàn)篩選菌株土壤來源于克山縣大豆種植農(nóng)田。

（2）培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化鈉5g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml。121℃滅菌20min。

阿斯貝無氮培養(yǎng)基：葡萄糖 1%；磷酸氫二鉀 0.02%；氯化鈉 0.02%；一水硫酸鎂 0.02%；硫酸鉀 0.02%；碳酸鈣 0.5%；瓊脂 1.5%～2.0%；蒸餾水；112℃滅菌20min。

生理生化鑒定培養(yǎng)基：不同濃度的氯化鈉培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、甲基紅液體培養(yǎng)基、伏-普培養(yǎng)基、吲哚培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫氫酶培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基，葡萄糖氧化發(fā)酵液體培養(yǎng)基，配制方法詳見參考文獻(xiàn)。

2.2 儀器設(shè)備

表1 試驗(yàn)所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)介

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 菌種采集

稱取10g土壤，溶于90ml無菌水中，置于搖床中37℃振蕩25min，靜置備用。

2.3.2 固氮菌的分離

將各稀釋倍數(shù)的菌液涂布于阿斯貝無氮培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度三個(gè)平行樣品。將各平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2.3.3 固氮菌的純化

觀察菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)的單個(gè)純菌落，在阿斯貝無氮培養(yǎng)基上進(jìn)行多次三區(qū)劃線分離，確定為純菌株后，接種保存。

2.3.4 固氮菌的鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察。觀察菌落形態(tài)，記錄菌落的形狀，顏色，邊緣，表面，干燥或濕潤，隆起狀況及透明度。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色，觀察結(jié)果，并測(cè)定菌體大小。

（2）生理生化鑒定試驗(yàn)。對(duì)菌體進(jìn)行檸檬酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、伏-普試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和不同濃度的氯化鈉試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌落形態(tài)觀察

用阿斯貝培養(yǎng)基從土壤中分離出來的菌種，其菌落形態(tài)為：圓形、無色、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、凸起，透明。見圖1。

圖1 阿斯貝培養(yǎng)基上分離純化出的固氮菌

3.2 革蘭氏染色結(jié)果

對(duì)分離純化后的菌種進(jìn)行革蘭氏染色，干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。觀察結(jié)果為：革蘭氏陰性，桿狀，菌體大小為（1～2）×（2～6）μm，但菌體自身不著色。

圖2 革蘭氏染色結(jié)果

3.3 生理生化鑒定結(jié)果

表2 試驗(yàn)菌株的生理生化鑒定結(jié)果

表3 需氧和厭氧條件下葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從大豆農(nóng)田土壤中成功分離出一株固氮菌，其菌株特性為：革蘭氏陰性，無芽孢，短桿狀細(xì)菌。其菌落形態(tài)為：圓形、無色、邊緣圓滑、表面光滑、濕潤 、突起、透明。該菌在低鹽濃度下生長；不能使明膠液化；不能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚；有硝酸鹽還原作用；伏-普反應(yīng)陰性；甲基紅反應(yīng)陽性；苯丙氨酸脫氫酶反應(yīng)陰性；檸檬酸鹽反應(yīng)陰性；在厭氧條件下，不利用葡萄糖，不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣；在有氧條件下，利用葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

〔1〕張福全.生物固氮菌劑的推廣應(yīng)用.內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì).2003，12：53～54.

〔2〕賈小明，洪健.固氮菌孢囊的誘導(dǎo)及其超微結(jié)構(gòu).浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）.2001，27（4）：443～446.

〔3〕宋鐵英，鄭偉文，陳永聰，李三署.固氮菌的分離及其對(duì)抗菌素耐藥試驗(yàn)初報(bào).福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).1999，14（增刊）：181～186.

〔4〕楊從發(fā)，王淑軍，陳靜，許興友.自生固氮菌的分離鑒定.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào).1999，8（3）：56～58.

〔5〕蒲一濤，鐘毅滬.固氮菌和纖維素分解菌對(duì)固氮的影響.深圳大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版）.1999，16（4）：61～65.

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〔7〕東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).第一版.北京：科技出版社，2001：353～384.

〔8〕沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn).第三版.北京：高等教育出版社，1999：26～28.

Isolation，purification and property identification of Azotobacter in the soil

FuBin（Environment Monitoring Center Station of Qiqihaer City Qiqihaer HeiLongjiang 161005）

In this experimentation，Ashby medium was used to seperate and purify the strains，and through a series of laboratory experiments，such as indol test，suger fermentation test and other seven tests the strains were identified.At last，a G-and non-sporiferous bacillus was got.This experimentation is good for screening out the Azotobacter from the bacteria manure，and it is also the basis of producing the high quality nitrogenfixing bacteria manure.

Azotobacter Ashby medium Seperation and Purification Identification

X53

A

1674-263X（2016）01-0017-03

2016-02-12

付斌（1983-），女，碩士，工程師，從事環(huán)境監(jiān)測(cè)工作。