戴冰，楊夢琳，張嘉妮，李玉星，歐陽林旗，肖子曾*，鄧桂明，楊磊

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

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實(shí) 驗(yàn) 研 究

六味地黃湯及其“一補(bǔ)一瀉”藥對(duì)對(duì)腎陰虛模型小鼠HPT軸的影響

戴冰1，楊夢琳2，張嘉妮1，李玉星1，歐陽林旗1，肖子曾2*，鄧桂明1，楊磊1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

目的：觀察六味地黃湯及三個(gè)“一補(bǔ)一瀉”藥對(duì)對(duì)腎陰虛模型小鼠下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸的影響。方法：將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和給藥組(六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組、熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組)共6個(gè)試驗(yàn)組；連續(xù)9天分別灌胃給予以上對(duì)應(yīng)藥物；第5～9天，除空白組灌胃蒸餾水外，其他各組按50 mg/kg每天灌胃氫化可的松注射液，制備小鼠腎陰虛模型，測定體質(zhì)量，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、甲狀腺激素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)含量，觀察甲狀腺組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：腎陰虛模型小鼠體質(zhì)量降低，血漿cAMP含量、血清TSH、T3、T4含量升高；六味地黃湯及其山茱萸-丹皮藥對(duì)降低HPT軸中垂體分泌的TSH含量、下調(diào)腎上腺分泌的T3、T4含量，修復(fù)受損甲狀腺組織。結(jié)論：六味地黃湯改善腎陰虛證的作用機(jī)制可能與降低HPT中垂體分泌的TSH、下調(diào)腎上腺分泌的T3、T4，修復(fù)受損甲狀腺組織有關(guān)。其中山茱萸-丹皮藥對(duì)是全方改善腎陰虛證的主要藥效物質(zhì)。

六味地黃湯；補(bǔ)瀉藥對(duì)；腎陰虛模型；下丘腦-垂體-甲狀腺軸

六味地黃湯出自宋代醫(yī)家錢乙《小兒藥證直訣·卷下》， 由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓組成，熟地、山茱萸、山藥合用，補(bǔ)腎、肝、脾之不足即“三補(bǔ)”，澤瀉、丹皮、茯苓合用，瀉腎、肝、脾之有余即“三瀉”；其中“一補(bǔ)一瀉”藥對(duì)：澤瀉甘寒泄腎濕濁，與熟地合用，防其滋膩太過；丹皮辛苦清泄肝火與山茱萸合用，可制山茱萸之溫澀；茯苓甘淡淡滲脾濕，與山藥合用，助山藥之健運(yùn)，使該方具有滋補(bǔ)而不留邪，降泄而不傷正的滋補(bǔ)腎陰功效[1-3]。但目前對(duì)六味地黃湯作用機(jī)制及其配伍原理的研究多以整方及拆方“三補(bǔ)”“三瀉”為主線開展，由于腎陰虛患者通常表現(xiàn)為神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的HPT軸功能紊亂[4]，因此從HPT軸入手來探究整方及拆方“一補(bǔ)一瀉”藥對(duì)改善腎陰虛證的作用機(jī)制很有必要，這對(duì)揭示該方的配伍原理具有一定的科學(xué)意義。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004；飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物

按六味地黃湯(熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g，茯苓9 g)稱取原藥材2劑，飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。再按六味地黃湯中各藥對(duì)的比例分別稱取山茱萸-丹皮藥對(duì)、熟地黃-澤瀉藥對(duì)、山藥-茯苓藥對(duì)，各2劑，各組藥材均加6倍量水，浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min，合并2次藥液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，均得最終濃度為1.5 g/ml的濃縮液。

1.3 主要試劑

氫化可的松注射液(安陽九州藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)140820001A)；碘[125I]促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析藥盒(批號(hào)150820)、碘[125I]三碘甲狀腺原氨酸(T3)放射免疫分析藥盒(批號(hào)150820)、碘[125I]甲狀腺素(T4)放射免疫分析藥盒(批號(hào)150820)(北京北方生物技術(shù)研究所)；環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R&D systems)。

1.4 主要儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；羅氏全自動(dòng)生化儀(型號(hào)：Modular DPP)；小型冷凍離心機(jī)(型號(hào)：centrifuge 5415R)；Shandon325型石蠟切片機(jī)(英國 Shandon公司)；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分組

取昆明小鼠60只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分成空白組、模型組、六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組、熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組，每組10只小鼠。

2.2 給藥

分組后第2天開始，連續(xù)9天，各組分別灌胃給予蒸餾水、蒸餾水、六味地黃湯藥液9.75 g/(kg·d)、山茱萸-丹皮藥液2.73 g/(kg·d)、熟地-澤瀉藥液4.29 g/(kg·d)、山藥-茯苓藥液2.73 g/(kg·d)；給藥劑量按照人與小鼠等效劑量系數(shù)折算法算出。

2.3 造模

第6～9天除空白組灌胃蒸餾水外，其他各組均每天下午15:00灌胃氫化可的松注射液為50 mg/kg。

2.4 標(biāo)本采集與處理

末次給藥后禁食24 h，于試驗(yàn)第10天摘眼球采血，分離血清及血漿；取血后立即摘取甲狀腺，放置于裝有10%甲醛的凍存管中保存待測。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 癥狀觀察、體質(zhì)量測定

從試驗(yàn)開始，每日觀察并記錄小鼠癥狀，于造模前、后各測量小鼠體質(zhì)量1次，并記錄。將死亡小鼠剔除試驗(yàn)。

2.5.2 cAMP、cGMP含量測定

小鼠摘眼球采血(采血管中加入肝素鈉)，血樣放置30 min后，3500 r/min離心15 min，取上清按試劑盒說明進(jìn)行檢測。

2.5.3 TSH、T3、T4含量測定

小鼠摘眼球采血(普通采血管)，血樣放置30 min后，3500 r/min離心15 min，取上清按試劑盒說明進(jìn)行檢測。

2.5.4 甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察

各組小鼠甲狀腺用10%甲醛固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片后，用蘇木素-伊紅(HE)染色后，常規(guī)顯微鏡下觀察各組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)腎陰虛模型小鼠癥狀、體質(zhì)量的影響

與空白組比較，模型組體質(zhì)量有顯著性差異(P<0.01)，并出現(xiàn)煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結(jié)、飲食增多等癥狀，隨著給藥時(shí)間延長，上述癥狀逐漸加重。六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組能減緩腎陰虛模型小鼠體質(zhì)量下降的趨勢，且能改善模型小鼠腎陰虛癥狀：小鼠表現(xiàn)較溫順、毛發(fā)有光澤、大便無干結(jié)，少拱背扎堆現(xiàn)象。熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組不能減緩腎陰虛模型小鼠體質(zhì)量下降的趨勢，且不能改善模型小鼠腎陰虛癥狀：小鼠煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁、易脫落。結(jié)果見圖1。

圖1 六味地黃湯及其“補(bǔ)瀉”藥對(duì)對(duì)模型小鼠體質(zhì)量的影響

3.2 對(duì)腎陰虛模型小鼠血漿cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響

與空白組比較，模型組血漿cAMP含量、cGMP含量、cAMP/cGMP比值均有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸組、山茱萸-丹皮組的血漿cAMP含量、cAMP/cGMP比值均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；六味地黃丸組血漿cGMP含量亦有顯著性差異(P<0.05)，熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組血漿cAMP含量、cGMP含量、cAMP/cGMP比值無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示,六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對(duì)能抑制腎陰虛模型小鼠血漿cAMP含量、cAMP/cGMP比值上升的趨勢，六味地黃湯還能抑制血漿cGMP含量下降的趨勢，使其血漿cAMP、cGMP含量，cAMP/cGMP比值基本恢復(fù)到正常水平。結(jié)果見表1。

3.3 對(duì)腎陰虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量的影響

與空白組比較，模型組血清TSH、T3、T4含量有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組血清TSH、T3、T4含量有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組血清TSH、T3、T4含量無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示,六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對(duì)能減緩腎陰虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量上升的趨勢，且能使其血清TSH、T3、T4含量基本恢復(fù)到正常水平；熟地-澤瀉藥對(duì)、山藥-茯苓藥對(duì)不能減緩腎陰虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量上升的趨勢。結(jié)果見表2。

表1 六味地黃湯及其“補(bǔ)瀉”藥對(duì)對(duì)模型小鼠cAMP、cGMP含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與六味地黃湯組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與山茱萸-丹皮組比較，%P<0.05，%%P<0.01。

表2 六味地黃湯及其“補(bǔ)瀉”藥對(duì)對(duì)模型小鼠TSH、T3、T4含量的影響

注：與空白組比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比，#P<0.05，##P<0.01；與六味地黃湯組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與山茱萸-丹皮組比較，%P<0.05，%%P<0.01。

3.4 對(duì)腎陰虛模型小鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)的影響

空白組甲狀腺濾泡大小基本一致，呈圓形或橢圓形，內(nèi)部充滿紅染膠質(zhì)，膠質(zhì)染色均勻，濾泡間無水腫，上皮細(xì)胞無增生。腎陰虛模型組甲狀腺濾泡大小不一，少數(shù)濾泡膠質(zhì)稀薄甚至缺失，濾泡壁上皮細(xì)胞明顯增生；六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組甲狀腺濾泡大小正常，濾泡壁上皮細(xì)胞完整，內(nèi)部充滿紅染膠質(zhì)，膠質(zhì)染色均勻，基本無稀薄或缺失。熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞有增生，大部分濾泡膠質(zhì)稀薄，濾泡間有水腫。結(jié)果提示,腎陰虛模型小鼠甲狀腺組織均受損，六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對(duì)能修復(fù)腎陰虛模型小鼠受損甲狀腺組織，熟地-澤瀉藥對(duì)、山藥-茯苓藥對(duì)不能修復(fù)腎陰虛模型小鼠受損甲狀腺組織。結(jié)果見圖2。

圖2 六味地黃湯及其“補(bǔ)瀉”藥對(duì)對(duì)模型小鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)的影響

4 討論

目前常用的腎陰虛模型造模方法有(促)腎上腺皮質(zhì)激素法、甲狀腺素法、甲狀腺素聯(lián)用利血平法、條件反射結(jié)扎腎動(dòng)脈法、熱性中藥法等，其中(促)腎上腺皮質(zhì)激素法是運(yùn)用較早，應(yīng)用最為廣泛，且較為公認(rèn)造模方法，本實(shí)驗(yàn)即采用該方法給予小鼠大劑量，短時(shí)間灌胃氫化可的松造模。考慮到中藥起效較緩慢，而該實(shí)驗(yàn)造模時(shí)間又短，為了使藥物有足夠的時(shí)間發(fā)揮其療效，本實(shí)驗(yàn)中除空白組與模型組外，其余各組小鼠均預(yù)防性給藥。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發(fā)枯槁易脫落、大便干結(jié)、飲食增多等癥狀，且cAMP升高，與夏炳江[5]、王萍[6]等報(bào)道的腎陰虛模型表現(xiàn)基本一致，提示腎陰虛模型造模成功；而六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對(duì)可改善腎陰虛證。

HPT軸由下丘腦、垂體與甲狀腺組成的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一。該軸中TSH是由腺垂體合成分泌的一種直接調(diào)節(jié)甲狀腺形態(tài)和功能的關(guān)鍵激素，它既能維持甲狀腺濾泡細(xì)胞的生長發(fā)育，又能促進(jìn)T3、T4的合成和分泌；甲狀腺合成分泌T3、T4，這兩種激素具有促進(jìn)物質(zhì)與能量代謝的作用。甲狀腺功能主要受下丘腦與垂體的調(diào)節(jié)，下丘腦釋放促甲狀腺激素釋放激素(TRH)，調(diào)節(jié)腺垂體分泌TSH，TSH進(jìn)一步引起甲狀腺激素的釋放，血液甲狀腺激素濃度變化通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦TRH和垂體TSH的分泌，構(gòu)成HPT軸的自發(fā)性控制環(huán)路。現(xiàn)代研究表明，腎陰虛患者HPT軸中TSH、T3、T4水平升高[7]。故六味地黃湯改善腎陰虛證的作用機(jī)制之一可能與降低垂體分泌的TSH水平，甲狀腺分泌的T3、T4水平，修復(fù)受損甲狀腺組織有關(guān)。

本研究中山茱萸-丹皮藥對(duì)改善腎陰虛證及其作用機(jī)制與六味地黃湯無差異，故山茱萸-丹皮藥對(duì)可能是全方改善腎陰虛證的主要藥效物質(zhì)之一，但該藥對(duì)中有哪些藥效成分，它們是否通過HPT軸來改善腎陰虛證有待進(jìn)一步研究。該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)熟地-澤瀉藥對(duì)、山藥-茯苓藥對(duì)不能改善腎陰虛證；但它們與山茱萸-丹皮配伍后即全方改善腎陰虛證作用最佳，這充分體現(xiàn)六味地黃湯在方中運(yùn)用“一補(bǔ)一瀉”三對(duì)藥對(duì)補(bǔ)瀉并用，以補(bǔ)為主，以瀉為輔，共同支撐方劑表達(dá)良好的滋陰補(bǔ)腎的配伍特色。

[1] 楊林,孫靜,郝璐.六味地黃丸組方的臨床應(yīng)用及研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,34(5):796-798.

[2] 梁華，朱明雪，孫燕佩,等.六味地黃丸、金匱腎氣丸的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012,40(2):97-99.

[3] 孫琳林，王書惠，盧林,等.左歸丸與六味地黃丸對(duì)衰老大鼠抗氧化能力及海馬區(qū)超微結(jié)構(gòu)影響的比較研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012,40(3):140-143.

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湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.15A140)；康爾佳藥業(yè)集團(tuán)糖尿病研究所支持項(xiàng)目；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.13JJ3096)

戴冰(1964-)，女，博士，教授，主要研究方向：臨床中藥學(xué)。

肖子曾*,教授，主要研究方向：方劑的應(yīng)用及療效機(jī)理研究。

2016-05-12

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0019-04

修回日期：2016-06-10