陳 佩,黨 輝,王 偉,陳 衛(wèi)

(1.陜西廣播電視大學(xué)，陜西西安 710119;2.陜西理工學(xué)院,生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001;3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;4.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

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具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌生物學(xué)特性研究

陳 佩1,2,黨 輝3,4,王 偉1,陳 衛(wèi)3,*

(1.陜西廣播電視大學(xué)，陜西西安 710119;2.陜西理工學(xué)院,生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001;3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;4.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

本研究旨在評(píng)價(jià)一株具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌的生物學(xué)特性。結(jié)果表明,該菌株生長(zhǎng)較快,2 h進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,最適生長(zhǎng)pH為5～7,最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃,最適接種量為1%～2%(V/V)。此外,該菌株在強(qiáng)酸條件下可以生長(zhǎng),對(duì)人工胃腸液都具有很好的耐受性,耐受膽鹽的延遲時(shí)間為0.86 h,在NaCl濃度為9%(W/V)的培養(yǎng)條件下仍可以存活。更為重要的是,這株菌對(duì)Caco-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的粘附能力。綜上所述:該鼠李糖乳桿菌菌株可作為一株具有潛在降糖作用的發(fā)酵菌株,用以開(kāi)發(fā)具有降糖作用的新型發(fā)酵產(chǎn)品。

降糖,鼠李糖乳桿菌,生物學(xué)特性

糖尿病(Diabetes Mellitus)是由多種病因引起的代謝性疾病[1]。我國(guó)糖尿病患者人數(shù)在過(guò)去30年中快速增長(zhǎng)了近10倍[2]。目前我國(guó)糖尿病人數(shù)已超過(guò)1億,成為全球糖尿病人數(shù)第一大國(guó)[3]。因此,對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療有非常迫切的需求。

近年來(lái),乳酸菌被證實(shí)具有預(yù)防和治療糖尿病的作用。1997年開(kāi)始Matsuzaki[4]等人發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌可降低NIDDM KK-Ay小鼠的血糖,并改善機(jī)體免疫。Ma[5]等研究表明VSL#3(雙歧桿菌,唾液鏈球菌,乳酸桿菌)可預(yù)防自發(fā)性糖尿病的發(fā)生。Laitinen[6]等發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌可以很好的控制孕婦生產(chǎn)前后的血糖水平,使其具有良好的葡萄糖耐受性,并可提高胰島素敏感性。Yun[7]等研究表明加氏乳桿菌可降低血糖并改善db/db小鼠糖尿病癥狀。Andreasen[8]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌可以改善正常志愿者、糖耐量受損病人和Ⅱ型糖尿病患者的胰島素敏感性,并且植物乳桿菌能夠降低糖尿病小鼠血糖。Naito[9]等表明乳酸桿菌代田株能夠改善糖尿病小鼠的糖耐量。Moroti[10]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌顯著降低糖尿病老年患者血糖水平。Ejtahed[11]研究表明嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌改善Ⅱ型糖尿病人空腹血糖并具有抗氧化作用。因此,篩選具有降糖作用的乳酸菌仍然是一個(gè)重要的課題。本實(shí)驗(yàn)在前期已篩選并證明鼠李糖乳桿菌具有降糖作用[12],在此研究基礎(chǔ)上,本文主要研究這株鼠李糖乳桿菌的生物學(xué)特性,以期為后續(xù)的生產(chǎn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳酸桿菌 江南大學(xué)食品生物與技術(shù)中心菌株保藏庫(kù);胃蛋白酶(1∶10000)、胰蛋白酶(1∶250)、巰基乙酸鈉 美國(guó)sigma公司;人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株 上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清、雙抗(青、鏈霉素) 美國(guó)Gibico公司。

SW-CJ-1CV超凈臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼科上海有限公司;5415R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;CX41-12C02倒置顯微鏡 日本Olympus公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶 美國(guó)Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌的制備 將凍存于-80 ℃的鼠李糖乳酸桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化三代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鼠李糖乳桿菌在人工模擬胃腸液中的生長(zhǎng)測(cè)定 人工模擬胃腸液需新鮮配制。用PBS(pH3.0)配制濃度為3 g/L的胃蛋白酶,過(guò)0.22 μm濾膜后制備成所需模擬胃液。用PBS(pH8.0)配置濃度為1 g/L的胰蛋白酶,過(guò)0.22 μm濾膜后制備成模擬腸液[13]。

乳酸菌以生理鹽水重懸,并將其菌液密度在模擬胃液(pH3.0)中調(diào)節(jié)至 1×109CFU/mL,充分混勻,在37 ℃培養(yǎng)1、2和3 h后檢測(cè)活菌數(shù)。3 h后,取模擬胃液(pH3.0)中的培養(yǎng)液1 mL加入至9 mL的模擬腸液(pH8.0)中,充分混勻,在37 ℃培養(yǎng)2、4和8 h后檢測(cè)活菌數(shù)[14]。用MRS固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h,乳酸菌的存活率用以下公式計(jì)算:

存活率(%)=log cfu N1/log cfu N0×100

N1=經(jīng)過(guò)模擬胃腸液處理之后的乳酸菌活菌數(shù),N0=未處理前乳酸菌的活菌數(shù)[15]。

1.2.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌,以2%的接種量分別接種于含有或不含0.3%膽鹽的MRS-THIO(MRS含有0.2%的巰基乙酸鈉)培養(yǎng)中,充分混合均勻,在37 ℃下培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)基吸光值到達(dá)0.3個(gè)單位時(shí)各組所需的時(shí)間,不加膽鹽與加了膽鹽兩組的時(shí)間差即為鼠李糖乳桿菌在膽鹽中生長(zhǎng)的延遲時(shí)間(LT),延遲時(shí)間的長(zhǎng)短,反映了乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受能力。時(shí)間越短,說(shuō)明耐受膽鹽的能力越強(qiáng),反之則耐受膽鹽的能力越弱[16]。

1.2.4 鼠李糖乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附能力測(cè)定 以含有20%胎牛血清,1% L-谷氨酰胺,1%非必需氨基酸和1%雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞,37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每天換液,待細(xì)胞增殖融合率達(dá)到80%左右時(shí),胰酶消化后按照1∶3進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

Caco-2細(xì)胞以4×104cell/孔接種于6孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鼠李糖乳桿菌離心后用PBS(pH7.2)沖洗3次,重懸于高糖DMEM完全培養(yǎng)基中,調(diào)整菌液濃度為1×109CFU/mL,加入到已生長(zhǎng)好的Caco-2細(xì)胞單層中,37 ℃培養(yǎng)2 h。再以PBS沖洗細(xì)胞單層3次,后用甲醇固定30 min,再進(jìn)行革蘭氏染色。隨機(jī)找20個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞,以平均每個(gè)細(xì)胞上粘附的鼠李糖乳桿菌數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)其粘附能力[17]。

1.2.5 鼠李糖乳桿菌對(duì)NaCl的耐受能力測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌,以2%接種量分別接入到NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、2%、4%、6%、7%、8%、9%(w/v)的MRS液體培養(yǎng)基中,充分混合均勻,在37 ℃下培養(yǎng)18 h后測(cè)定其菌液OD600 nm值[18]。

1.2.6 鼠李糖乳桿菌的最適接種量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌,按接種量0.5%、1%、1.5%、2%、5%和10%(v/v)分別加入到MRS液體培養(yǎng)基中,充分混合均勻,在37 ℃下培養(yǎng)18 h后測(cè)定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.7 鼠李糖乳桿菌的最適pH測(cè)定 以HCl(1 mol/L)調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基pH分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5和7.0,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌,以2%的接種量接種,充分混合均勻,在37 ℃下培養(yǎng)18 h后測(cè)定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.8 鼠李糖乳桿菌的最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌,按接種量2%接種后,分別在22、26、34、37、42 ℃下培養(yǎng)18 h后測(cè)定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.9 鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠李糖乳桿菌,以2%的接種量接入到MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣,測(cè)定其菌液OD600 nm值[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌在人工模擬胃液(pH3.0)中的存活率

人體胃液的pH(2.5～3.5)一般維持較低水平,是阻止細(xì)菌進(jìn)入腸道的天然屏障,一般食物在胃中消化停留時(shí)間為2～4 h[13]。乳酸菌要進(jìn)入腸道發(fā)揮其益生作用,首先應(yīng)該具有耐受胃液的能力。圖1表明,鼠李糖乳桿菌在人工模擬胃液(pH3.0)中可存活3 h,并且存活率大于80%。Matsumoto[20]等研究發(fā)現(xiàn)菌株的耐酸能力大小,與菌株的H+-ATP酶活性有關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)中的鼠李糖乳桿菌具有較好的耐酸能力,可能與其H+-ATP酶活性有關(guān)。

圖1 鼠李糖乳桿菌在模擬胃液(pH3.0)中的存活率Fig.1 Survival rate of L. rhamnosus to simulated gastric juice(pH3.0)

2.2 鼠李糖乳桿菌在人工模擬腸液(pH8.0)中的存活率

如圖2所示,鼠李糖乳桿菌在模擬腸液(pH8.0)中可存活8 h,且存活率可達(dá)到90%以上,這與Haarman[21]等研究結(jié)果一致,乳桿菌在腸液中的存活率較高,故其是人體腸道中的主要益生菌群。

圖2 鼠李糖乳桿菌在模擬腸液(pH8.0)中的存活率Fig.2 Survival rate of L. rhamnosus to simulated intestinal juice(pH8.0)

2.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受性

人體腸道中膽鹽的含量大約為0.3%,乳酸菌經(jīng)攝入后,先后經(jīng)過(guò)人體的胃和小腸,最終才能定殖。目前,菌株對(duì)于膽鹽的耐受能力已經(jīng)成為評(píng)價(jià)菌株是否能夠在腸道中生存與定殖的一個(gè)重要條件[22]。表1中所示,本實(shí)驗(yàn)中的鼠李糖乳桿菌對(duì)于膽鹽的延遲時(shí)間為0.86 h,說(shuō)明此菌株對(duì)膽鹽具有很好的耐受性。

表1 膽鹽對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的作用Table 1 Effect of bile salts on the growth rate of L. rhamnosus

2.4 鼠李糖乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附能力

為了調(diào)節(jié)腸道菌群,發(fā)揮益生作用,乳酸菌必須能夠在胃腸道中良好定殖,粘附是乳酸菌與宿主細(xì)胞相互作用的第一步[23]。因此,菌株的粘附能力是評(píng)價(jià)其是否能夠成為優(yōu)良菌株的一個(gè)必要條件。Caco-2細(xì)胞是一種人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞,結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于分化的小腸上皮細(xì)胞,可以較好的模擬人體腸道中的環(huán)境。

圖3中可看出,鼠李糖乳桿菌菌體形態(tài)完整,并且對(duì)Caco-2細(xì)胞具有一定的粘附能力,依據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明粘附率為10 個(gè)/cell。由此推測(cè),鼠李糖乳桿菌在人體腸道中應(yīng)具有較好的定殖能力。李清[24]等研究表明菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附能力與其表面蛋白類(lèi)物質(zhì)及其他大分子物質(zhì)有關(guān)。

圖3 鼠李糖乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附形態(tài)(×400)Fig.3 The morphology of adherent of L. rhamnosus to Caco-2 cells(×400)

2.5 鼠李糖乳桿菌對(duì)NaCl的耐受性

鼠李糖乳桿菌對(duì)NaCl具有較強(qiáng)的耐受能力,其在NaCl濃度為9%時(shí)仍然可以生長(zhǎng)。如圖4所示,當(dāng)NaCl濃度超過(guò)4%后,菌株的生長(zhǎng)能力急劇下降。

圖4 不同NaCl濃度下鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)情況Fig.4 The growths of L. rhamnosus in different levels of sodium chloride

2.6 鼠李糖乳桿菌在不同接種量下的生長(zhǎng)情況

圖5 不同接種量對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 The growth effect of the L. rhamnosus in different inoculums densities

不同接種量下菌株的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖5。隨著接種量的增加鼠李糖乳桿菌的OD值呈上升趨勢(shì),相應(yīng)的pH呈下降趨勢(shì)。綜合考慮,菌株培養(yǎng)時(shí)可選取的最適接種量在1%～2%之間,培養(yǎng)液的pH在4.4左右。

2.7 鼠李糖乳桿菌在不同pH下的生長(zhǎng)情況

鼠李糖乳桿菌在不同pH中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖6,結(jié)果表明菌株生長(zhǎng)的最適pH為5～7。該菌株在pH2的低酸環(huán)境中依然可以生長(zhǎng),說(shuō)明其有較好的耐酸性,這與本文之前耐受人工胃液的結(jié)果一致。

圖6 不同pH對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 The growth effect of the L. rhamnosus in different pH

2.8 鼠李糖乳桿菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況

鼠李糖乳桿菌在不同溫度中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖7,結(jié)果表明菌株在溫度為22～42 ℃范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng),pH隨著菌液OD值的變化而有相應(yīng)的變化。綜合考慮,此菌株的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃,培養(yǎng)液的pH在4.4左右。

圖7 不同溫度對(duì)鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 The growth effect of the L. rhamnosus in different temperature

2.9 鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)曲線

鼠李糖乳桿菌的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖8,結(jié)果表明此菌株的生長(zhǎng)周期較短,培養(yǎng)2 h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖8 菌液OD值隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig.8 The changes of bacteria liquid OD value with culture time

3 結(jié)論

目前,全球的糖尿病發(fā)病率和患者總數(shù)都呈逐年增加的趨勢(shì),而傳統(tǒng)降糖藥物的使用會(huì)引發(fā)一系列的副作用,因此人們逐漸將目光投入到更安全的天然食品,以尋求理想的降糖保健食品。國(guó)內(nèi)外的研究表明乳酸菌通過(guò)調(diào)節(jié)宿主腸道菌群達(dá)到降糖的作用,篩選具有降糖作用的乳酸菌是一個(gè)非常有意義的課題。本研究對(duì)一株具有潛在的降糖作用的鼠李糖乳桿菌生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該菌株在強(qiáng)酸條件下可以生長(zhǎng),對(duì)人工胃腸液都具有很好的耐受性,耐受膽鹽的延遲時(shí)間為0.86 h,在高濃度的NaCl(9%,W/V)溶液中仍可以存活,并且該菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的粘附能力。故該菌株可以作為潛在降糖的益生菌,未來(lái)可進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)出具有降糖作用的新型發(fā)酵產(chǎn)品。

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Biological characteristics ofLactobacillusrhamnosuswith antidiabetic activity

CHEN Pei1,2,DANG Hui3,4,WANG Wei1,CHEN Wei3,*

(1.Shaanxi Radio & TV University,Xi’an 710119,China;2.Shaanxi University of Technology,School of Biological Science and Engineering,Hanzhong 723001,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4. College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

ToinvestigatethebiologicalcharacteristicsofaLactobacillus rhamnosusstrainwithanti-diabeticactivity.TheresultsshowedthatthelogarithmictimeofthisLactobacillus rhamnosusstrainwasfrom2thhourto14thhour.TheoptimumpHandtemperatureforitsgrowthwas5～7and37 ℃,respectively,anditsoptimuminoculatedconcentrationwas1%～2%(V/V).Besides,thisstraincouldgrowunderstronglyacidicconditions,andsurviveinthesimulatedgastro-intestinaljuice.Thebiletoleranceofthisstrainintheformoflagtimewas0.86h,anditcouldgrowunder9%NaCl(W/V)conditions.Moreimportantly,itpossessedstrongadhesivepropertiestoCaco-2cells.Insummary,thisLactobacillus rhamnosusstrainwithantidiabeticactivitycouldbeappliedtodevelopnovelfermentedfoodproductswithhypoglycemiceffect.

antidiabetic;Lactobacillus rhamnosus;biologicalcharacteristics

2016-01-14

陳佩(1983-)，女，博士，講師，研究方向：食品微生物,E-mail:angelchen186@163.com。

*通訊作者:陳衛(wèi)(1966-)，男，博士，教授，研究方向：功能性益生乳酸茵的開(kāi)發(fā)及其在乳制品中的應(yīng)用，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2015NY025);陜西廣播電視大學(xué)重點(diǎn)課題(15D-08-A02)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.023