于曉明 王霞 黨曉宇

摘要：本實(shí)驗(yàn)以玉米品種B73和H99為實(shí)驗(yàn)材料，分別對(duì)其進(jìn)行干旱脅迫處理（0天、5天、7天、9天、11天），用MSAP方法分析干旱脅迫條件下的玉米基因組DNA甲基化變化情況。結(jié)果表明，干旱脅迫下，玉米DNA甲基化修飾發(fā)生了明顯的改變，包括甲基化水平變化和模式變化； B73與H99的甲基化變異程度存在差異，其中B73在處理7天時(shí)檢測(cè)到的變異率最高，為32.48%，H99在處理9天后的變異率最高，為30.00%。本研究初步分析了玉米在干旱脅迫下所發(fā)生的表觀遺傳學(xué)變異的頻率及其與玉米抗逆性之間可能存在的關(guān)系，為進(jìn)一步研究植物抗干旱脅迫的機(jī)制和培育抗干旱玉米新品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：玉米；干旱脅迫；DNA甲基化；MSAP

基金項(xiàng)目： 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130522062JH）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字[2012]第475號(hào)）

中圖分類號(hào)： S513；Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.16.021

1干旱對(duì)玉米DNA的影響

我國(guó)幅員遼闊，江河湖泊眾多，水資源從總量上講是較豐沛的。但是，由于我國(guó)人口基數(shù)大，人均淡水量?jī)H為世界平均水平的28.1%，位于世界第88位[1]。我國(guó)耕地主要分布于華北、東北、華東和中南4個(gè)區(qū)域，這4個(gè)區(qū)域的土地占全國(guó)土地面積的43.5%，但耕地面積卻占71.7%；西南、西北2個(gè)區(qū)域的耕地僅占全國(guó)耕地面積的28.3%[1]。近些年來，環(huán)境惡化、自然災(zāi)害嚴(yán)重、雨水資源分布不均、耕地面積縮減，都對(duì)我國(guó)糧食安全產(chǎn)生造成嚴(yán)重威脅。玉米是各種農(nóng)作物中能量貯藏最多的種類之一，因而玉米是重要的糧食、飼料以及能量來源。中國(guó)的玉米的種植總面積和總產(chǎn)量均居世界第二，未來氣候?qū)ξ覈?guó)的玉米產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響[2]。因此，玉米的單位產(chǎn)量及總產(chǎn)量持續(xù)提高對(duì)我國(guó)糧食安全有重大意義。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，世界上干旱和半干旱地區(qū)占陸地面積的比例達(dá)到34.9%，我國(guó)干旱及半干旱地區(qū)占國(guó)土面積的比例高達(dá)52%，每年受旱面積達(dá)200～270余萬畝。

DNA甲基化（DNA methylation）是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作為催化劑，在S-腺普甲硫氨酸提供甲基供體的基礎(chǔ)上完成催化反應(yīng)，產(chǎn)生出具有甲基的N-甲基腺嘌呤、N-甲基胞嘧啶和C一甲基胞嘧啶[3]。在真核生物中，DNA甲基化主要以5-甲基胞嘧啶的形式存在[4]。根據(jù)已有報(bào)道顯示，多種因素可以誘導(dǎo)嘧啶的甲基化。例如植物的轉(zhuǎn)基因方法能夠?qū)е缕浔旧砑盎蚪M中同源序列出現(xiàn)甲基化，從而產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象[5]；植物組織離體培養(yǎng)也能誘導(dǎo)甲基化變異的出現(xiàn)，這種現(xiàn)象是體細(xì)胞克隆發(fā)生變異的主要原因[6]；在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行種間雜交和水稻不同品系間雜交均可產(chǎn)生大量胞嘧啶甲基化[7，8]。

雖然通過對(duì)模式生物尤其是對(duì)擬南芥的研究， 已經(jīng)初步探明植物DNA甲基化產(chǎn)生和維持的機(jī)制以及在模式生物生命活動(dòng)中的生物學(xué)功能[9]， 但是目前對(duì)DNA甲基化對(duì)農(nóng)作物的影響研究還不夠深入[10]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)玉米進(jìn)行干旱處理，研究干旱與DNA甲基化之間的聯(lián)系，從而為利用DNA甲基化多態(tài)性進(jìn)行作物改良或去除脅迫印跡來提高作物的抗逆性提供理論基礎(chǔ)，對(duì)提高玉米產(chǎn)量具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

玉米品種B73和H99，經(jīng)不同時(shí)間（0天、5天、7天、9天、11天）的250mM甘露醇（干旱）脅迫處理。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 玉米干重測(cè)量 在玉米發(fā)芽15天后（V3期），分別稱取正常條件下和經(jīng)5天、7天、9天、11天干旱處理過（250 mM甘露醇模擬干旱脅迫）的玉米全株各20株，干燥箱烘干至恒重，稱量干重。

2.2.2 玉米DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）分析 提取玉米基因組DNA，進(jìn)行MSAP分析，包括：限制性酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增（MSAP實(shí)驗(yàn)方法與體系主要參照羅洋的研究[11]）。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物送交長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳和熒光信號(hào)讀取。統(tǒng)計(jì)MSAP擴(kuò)增條帶，信號(hào)值大于80時(shí)認(rèn)為有條帶記錄為1，小于80時(shí)認(rèn)為沒有條帶記錄為0。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 玉米干重分析

如圖1所示，B73和H99在干旱脅迫處理后，干重顯著下降。而且H99干重下降的程度比B73更大。B73干旱脅迫處理5天、7天、9天、11天后的干重分別為0.715、0.663、0.617、0.283；H99干旱脅迫處理5天、7天、9天、11天后的干重分別為0.846、0.756、0.676、0.400。干旱脅迫處理11天時(shí)B73和H99均降為最低。表明B73對(duì)干旱脅迫比H99更耐受。

圖1 玉米H99和B73干旱處理后的干重

3.2 干旱誘導(dǎo)的玉米DNA甲基化水平變異

如圖2所示，通過對(duì)擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)并比較，可以發(fā)現(xiàn)B73和H99在干旱脅迫處理后DNA甲基化情況都發(fā)生了明顯的變化。其中，B73正常條件下的CG甲基化水平為15.33%，干旱脅迫處理后CG甲基化水平呈略微下降趨勢(shì)；而H99與之相反，正常條件下CG甲基化水平為11.42%，干旱脅迫處理后CG甲基化水平呈略微上升趨勢(shì)。B73正常條件下CHG甲基化水平為16.27%，干旱處理后CHG甲基化水平呈先下降后在第11天時(shí)明顯上升；H99則是先下降后呈略微上升趨勢(shì)。上述結(jié)果表明，兩個(gè)玉米品種B73和H99的在應(yīng)答干旱脅迫過程中甲基化水平都發(fā)生了改變，但是二者甲基化水平變化的方式各不相同，暗示著不同玉米基因型中的甲基化背景對(duì)玉米應(yīng)答干旱脅迫中的甲基化水平變化是有影響的。

圖2 甲基化整體水平變異情況

注：B73-1，B73-2，B73-3，B73-4，B73-5分別為B73干旱處理0天，5天，7天，9天，11天；

H99-1，H99-2，H99-3，H99-4，H99-5分別為H99干旱處理0天，5天，7天，9天，11天。

3.3 DNA甲基化模式變異條帶統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)MSAP分析條帶表明，B73和H99經(jīng)干旱處理后的CG和CHG位點(diǎn)均發(fā)生了DNA甲基化模式的變異，且二者的甲基化模式變異頻率存在差異。B73處理中B73-2的DNA甲基化條帶數(shù)為973，占總甲基化的29.48%；B73-3的甲基化條帶數(shù)為1072，占32.48%；B73-4甲基化條帶數(shù)為915，占27.73%；B73-5甲基化條帶數(shù)為1015，占30.76%。H99處理中H99-2甲基化條帶數(shù)為826，占總甲基化的25.03%；H99-3甲基化條帶數(shù)為838，占25.39%；H99-4甲基化條帶數(shù)為990，占30.00%；H99-5甲基化條帶數(shù)為863，占26.15%。

如圖3所示，B73的干旱處理中5天、7天、9天主要以CG去甲基化變異為主，而處理11天時(shí)的CG和CHG位點(diǎn)的去甲基化和超甲基化模式變異率相差不大。H99各個(gè)處理主要以CHG去甲基化變異為主，且變異率成遞增趨勢(shì)。B73在處理7天時(shí)的甲基化模式變異率最高32.48%，而H99是在處理9天時(shí)的甲基化模式變異率最高30.00%。B73干旱處理后CG超甲基化呈先上升后下降趨勢(shì)，CHG去甲基化呈下降趨勢(shì)，但CG去甲基化和CHG超甲基化變化無規(guī)律；H99的CHG超甲基化呈先上升后下降趨勢(shì)，CHG去甲基化成上升趨勢(shì)，但CG吵架計(jì)劃和去甲基化無規(guī)律；B73和H99的both超甲基化和both去甲基化基本無變化。

圖3 甲基化模式變異情況

注：CG hyper：CG超甲基化，CG hypo：CG去甲基化，CHG hyper：CHG超甲基化，CHG hypo：CHG去甲基化，both hyper：both超甲基化，both hypo：both超甲基化。

3.4 討論

逆境脅迫下會(huì)導(dǎo)影響基因的表達(dá)，進(jìn)而大致DNA甲基化的變化。本實(shí)驗(yàn)通過MSAP分析方法對(duì)比兩種不同品種玉米的DNA甲基化變異情況，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下兩種玉米均發(fā)生了不同程度的甲基化變異。兩種玉米的CG和CHG位點(diǎn)同時(shí)甲基化程度變異基本無變化。在甲基化模式變異中，B73的CG超甲基化呈先上升后下降趨勢(shì)，CHG去甲基化呈逐漸降低趨勢(shì)；H99的CHG超甲基化呈先上升后下降趨勢(shì)，CHG去甲基化成呈逐漸遞增趨勢(shì)。B73主要以CG位點(diǎn)去甲基化為主，H99主要以CG位點(diǎn)超甲基化和CHG位點(diǎn)去甲基化為主。B73在干旱處理7天時(shí)CG去甲基化和超甲基化程度均達(dá)到最高分別為10.09%和6.91%，CHG去甲基化程度隨著干旱處理時(shí)間的增加而降低。H99的CHG去甲基化程度在逐漸升高，CG位點(diǎn)甲基化升降趨勢(shì)不同。B73在處理7天后的甲基化模式變異率最高32.48%，而H99是在處理9天后的甲基化模式變異率最高30.00%。但這些變化導(dǎo)致了哪個(gè)基因或是哪些基因的表達(dá)，影響了基因表達(dá)過程中的哪一步還不清楚，還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]劉煒.干旱脅迫誘導(dǎo)的水稻基因組胞嘧啶甲基化變化[D]. 長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)， 2006.

[2]馬玉平，孫琳麗， 俄有浩，等.預(yù)測(cè)未來40年氣候變化對(duì)我國(guó)玉米產(chǎn)量的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，26（01）： 224-232.

[3]馬開峰. 毛白楊基因組DNA甲基化遺傳變異及遺傳效應(yīng)[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2013.

[4]龍麗坤.高壓誘導(dǎo)水稻發(fā)生可遺傳DNA甲基化變異和轉(zhuǎn)座子mPing及Pong的轉(zhuǎn)座激活[D].長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)， 2006.

[5]Matzke A A， Matzke A J M， Eggleston W B.Paramutation and transgene silencing： a common response to invasive DNA[J]. Trend Plant Sci， 1996（11）：382.

[6]Phillips R L， Kaeppler S M， Olhoft P.Genetic instability of plant tissue culiure： breakdown of normal controls[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1994（91）：5，222.

[7]O'Neill R J， O'Neill M J， Granes J A M. Undennethyla

tionassociated with retroelement activation and chromosome remodeling in an intespecies mamrnalia hybrid[J]. Nature， 1998（393）：68.

[8]Xiong L Z， Xu C G， Maroof M A， et al. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines， detected by a methylation sensitive amplification technique[J]. Mol Gen Genet， 1999（261）：439.

[9]宋欣欣. 低氮水平下誘導(dǎo)的水稻DNA甲基化變異[D]. 長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)， 2009.

[10]楊美娜， 楊瑰麗， 郭濤. 逆境脅迫下植物DNA甲基化及其在抗旱育種中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2013， 29（06）：6-11.

[11]羅洋. 肥料和密度對(duì)玉米生長(zhǎng)發(fā)育及DNA甲基化的影響[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

通訊作者：于曉明，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，講師，研究方向：分子生物學(xué)與基因工程。