郗艷麗，白雪松，杜 鵑，張洋婷，馬洪波，牛鳳蘭

(1.吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132103； 2.吉林大學，長春 130021)

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沒食子酸對肺癌A549細胞的毒性作用及機制研究

郗艷麗1，白雪松1，杜 鵑1，張洋婷1，馬洪波1，牛鳳蘭2

(1.吉林醫(yī)藥學院，吉林 吉林 132103； 2.吉林大學，長春 130021)

沒食子酸；肺癌；A549細胞；過氧化氫

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人非小細胞肺癌細胞A549購于中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫，胎牛血清和RPMI-1640購于Hyclone公司，噻唑藍(MTT)、沒食子酸(GA)、吖啶橙(AO)、溴化乙錠(EB)和DHE染色液購于Sigma公司，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒和BCA檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，H2O2檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Tecan infinite M200連續(xù)光譜多功能酶標儀購于帝肯公司，Leica DMI 6000B倒置顯微鏡購于奧林巴斯公司，流式細胞儀購于BD公司。

1.2 MTT法檢測各組細胞存活率

A549細胞調(diào)節(jié)密度至1×105mL-1制成單細胞懸浮液，吸取200μL接種96孔板，待細胞完全貼壁后，移除上清液，加入200 μL預實驗篩選出的最佳濃度GA溶液，同時加入SOD溶液或者CAT溶液，設立只加GA溶液及不加藥物的空白溶液作為對照組，即將細胞分成空白對照組、GA、GA+SOD組和GA+CAT組。GA組GA終濃度為750 μmol·L-1，GA+SOD組GA終濃度為750μmol·L-1，SOD終濃度為3 000 U·L-1，GA+CAT組GA終濃度為750μmol·L-1，CAT終濃度為200 mg·L-1。24h后在490 nm 波長下檢測吸光度(A)值，計算細胞存活率(各組細胞存活率=A樣品組/A空白對照組)×100%。

1.3 熒光染色法觀察細胞形態(tài)

A549細胞以2.5×105mL-1密度接種6孔板，每孔接種2 mL單細胞懸浮液，待細胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)液，加入用不含血清培養(yǎng)基稀釋的藥物干預24h，吸棄藥物后，加入預冷的PBS洗滌3次，加入AO/EB(AO：0.1 mg·mL-1；EB：10 μL·mL-1)染色液避光孵育5min，吸棄未結(jié)合的染色液，用遇冷的PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察細胞并成像，實驗重復3次。

1.4 H2O2含量檢測

藥物處理24h后，吸棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化，1 000 rpm離心3 min收集細胞，吸棄上清后加入500μL PBS，液氮反復凍融直至細胞破碎，離心后收集上清，按照試劑盒說明書方法檢測，測各樣品管吸光度值并計算H2O2的含量。

胰蛋白酶消化并收集細胞，吸棄上清后加入濃度為10μg·mL-1的DHE染色液1 mL，37℃避光孵育30min，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，流式細胞儀立即檢測。

1.6 結(jié)果分析

2 結(jié)果

2.1 沒食子酸對A549細胞存活率的影響

與對照組比較(100±5)%，GA組和GA-SOD組A549細胞存活率(50.24±9.65)%和(25.10±1.36)%明顯降低(P<0.05)，GA-CAT組細胞存活率(78.07±2.59)%雖有降低，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與GA組比較，GA-CAT組A549細胞存活率明顯升高(P<0.05)，GA-SOD組A549細胞存活率降低，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GA-CAT組比較，GA-SOD組A549細胞存活率明顯降低，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 沒食子酸對A549細胞形態(tài)學的影響

對照組A549細胞致密，細胞與細胞之間連接緊密，細胞大小基本一致且形態(tài)規(guī)則；與對照組比較，GA組A549細胞密度降低，數(shù)量減少，細胞與細胞之間的間隙增大，許多細胞貼壁不牢，體積變??；GA-CAT組大部分A549細胞形態(tài)和大小與對照比較沒有明顯變化，只有少部分A549細胞呈現(xiàn)了細胞皺縮的形態(tài)改變，細胞密度也較對照組密度低；GA-SOD組A549細胞的細胞密度比對照組明顯減少，細胞變圓的數(shù)量增多。(見圖1A)。

對照組A549細胞呈現(xiàn)綠色熒光染色的細胞數(shù)量較多，紅色熒光染色的細胞數(shù)量較少，大部分細胞呈現(xiàn)活細胞狀態(tài)；GA組A549細胞呈現(xiàn)綠色熒光染色的細胞數(shù)量減少，紅色熒光染色的細胞數(shù)量明顯增多；GA-CAT組A549細胞綠色熒光染色的細胞數(shù)量較對照組少，但比GA組多，紅色熒光染色的細胞數(shù)量較對照組多，但較GA組數(shù)量少；GA-SOD組A549細胞較對照組、GA組和GA-CAT組紅色熒光染色的細胞數(shù)量多，且綠色熒光細胞數(shù)量少，表明細胞明顯呈現(xiàn)晚期凋亡和壞死狀態(tài)，且發(fā)生死亡的細胞占了大多數(shù)。(見圖1B)。

圖1 各組A549細胞形態(tài)學Fig.1 Morphology of A549 cells in various groups (A: The morphology of A549 cells observed under microscope; B: The A549 cells stained by AO and EB dyes)

與對照組H2O2含量(29.36±2.70)mmol/g比較，GA作用A549細胞后促進了H2O2含量(75.50±8.88)mmol/g的升高(P<0.05)，GA-CAT組A549細胞H2O2含量(54.84±6.14)mmol/g雖高于對照組，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，GA-SOD組A549細胞H2O2含量(102.55±15.10)mmol/g明顯高于對照組，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GA組比較，GA-CAT組A549細胞H2O2含量明顯降低，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GA-SOD組A549細胞H2O2含量明顯升高，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與GA-CAT組比較，GA-SOD組A549細胞H2O2含量明顯升高，且比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

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Toxic effects and mechanisms of gallic acid on lung cancer A549 cells

XI Yan-li1, BAI Xue-song1, DU Juan1, ZHANG Yang-ting1, MA Hong-bo1, NIU Feng-lan2

(1. Jilin Medical University, Jilin 132013, China; 2. Jilin University, Changchun 130021, China)

Gallic acid; Lung cancer; A549 cells; Hydrogen peroxide

2016-09-20

吉林省教育廳資助項目(2015403)；吉林市科技廳資助項目(201536113)

郗艷麗(1981-)，女，講師，博士。

馬洪波(1969-)，男，副教授，碩士； 牛鳳蘭(1951-)，女，教授，博士。

R734.2，R

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