成新琪，朱雪峰，程文翰，賀 雪，孫 杰，朱華國(guó)

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

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棉花多胺氧化酶基因( GhPAO3)的克隆及表達(dá)分析

成新琪，朱雪峰，程文翰，賀 雪，孫 杰，朱華國(guó)

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

根據(jù)擬南芥AtPAO5的cDNA序列在雷蒙德氏棉數(shù)據(jù)庫(kù)中Blastn比對(duì)獲得同源PAO基因，設(shè)計(jì)特異性引物并利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得1個(gè)陸地棉PAO基因，命名為GhPAO3。對(duì)GhPAO3的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：該基因cDNA全長(zhǎng)為1 736 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 530 bp，編碼506個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白大小為56.88 ku，等電點(diǎn)為5.77，編碼蛋白為親水性蛋白。Real-time PCR結(jié)果表明，GhPAO3在不同組織中的表達(dá)情況不同，表達(dá)量依次是葉>莖>根>花瓣>子房>雄蕊>種子>雌蕊。不同誘導(dǎo)處理下GhPAO3基因表達(dá)量也存在差異，其中低溫處理和ABA處理后該基因在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，PEG處理后在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，NaCl則在處理后3 h時(shí)表達(dá)量最高。表明GhPAO3基因受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可能以不同的角色參與棉花抗逆過(guò)程，結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

棉花；克??；多胺氧化酶；非脅迫處理

多胺是一類具有生物活性的、含有2個(gè)或2個(gè)以上氨基的低分子量脂肪族含氮堿，在生物生長(zhǎng)和適應(yīng)環(huán)境變化中扮演重要的角色[1-3]。植物體的多胺主要包括腐胺(Put)、尸胺(Cad)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)和熱精胺(Tspm)[4]，通過(guò)調(diào)節(jié)合成和分解代謝保持體內(nèi)多胺的動(dòng)態(tài)平衡。多胺的降解主要是通過(guò)二胺氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)催化來(lái)實(shí)現(xiàn)，二胺氧化酶作為銅酶氧化腐胺和尸胺，主要生成 4-氨基正丁醛、氨和H2O2。多胺氧化酶與輔酶FAD以非共價(jià)鍵結(jié)合，但多胺氧化酶有多個(gè)同源基因，因此代謝途徑分為2類，第1類催化精胺和亞精胺生成1,3-丙二胺(Dap)、H2O2和3-氨丙基-4-氨基正丁醛或4-氨基正丁醛[5-6]，如小麥PAO、玉米PAO1和水稻PAO7。第2類催化精胺生成亞精胺，再生成腐胺，同時(shí)生成3-氨基正丁醛和H2O2[7]。如擬南芥PAO(AtPAO1-AtPAO5)及水稻PAO(OsPAO1、OsPAO3、OsPAO4和OsPAO5)[8]。多胺氧化產(chǎn)生的H2O2作為一種信號(hào)分子參與植物體內(nèi)細(xì)胞的程序性死亡、細(xì)胞的防御性反應(yīng)、細(xì)胞質(zhì)木質(zhì)素合成和生物與非生物脅迫等過(guò)程[9-11]。

多胺氧化酶的研究在擬南芥、水稻及柑橘中較多。擬南芥的5個(gè)同源基因在不同組織中差異表達(dá)，AtPAO1主要在花的器官中表達(dá)，AtPAO2在花粉和長(zhǎng)角果中表達(dá)，AtPAO3在保衛(wèi)細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較高，AtPAO4在根表達(dá)量最高，AtPAO5則在根和子葉中表達(dá)量較高[12]。柑橘的6個(gè)PAO基因均在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[13]。水稻中研究7個(gè)同源PAO基因在花藥中的表達(dá)情況，OsPAO1、OsPAO2、OsPAO6不表達(dá)，OsPAO3、OsPAO4、OsPAO5在花藥的早期表達(dá)，并且OsPAO3在單細(xì)胞階段表達(dá)，OsPAO4在雙細(xì)胞階段表達(dá)，OsPAO5在三細(xì)胞階段表達(dá)，OsPAO7在花藥后期表達(dá)。另外，OsPAO7可能參與木質(zhì)素的合成，與花藥中木質(zhì)素對(duì)次生壁的增厚有關(guān)[8]。

棉花是新疆主要的經(jīng)濟(jì)作物，生物和非生物脅迫對(duì)棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)造成極大的負(fù)面影響，因?yàn)镻AO受非生物脅迫時(shí)可能會(huì)提高植物的抗逆性，擬南芥PAO4對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生響應(yīng)[14]，非生物脅迫柑橘時(shí)PAO3能夠產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[13]，所以對(duì)多胺氧化酶在非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)的研究具有重要意義。目前棉花多胺氧化酶基因GhPAO1和GhPAO2已被克隆，GhPAO1參與棉花的抗黃萎病過(guò)程[15-16]。本研究從陸地棉中克隆多胺氧化酶(PAO)基因，對(duì)其在不同組織和不同非生物脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為深入研究基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)材料陸地棉品種‘新陸早33號(hào)’由石河子大學(xué)棉花所提供?！玛懺?3號(hào)’種子經(jīng)濃硫酸脫絨，選取籽粒健康、飽滿的種子，在質(zhì)量濃度為1 g/L的汞中消毒10 min，去離子水沖洗3次，然后種植于無(wú)菌蛭石中，用Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)(28 ℃，晝/夜為14 h/10 h)，分別取棉花的不同組織(根、莖、葉和種子)、于盛花期在田間摘取的花(花瓣、雄蕊、雌蕊、子房)為材料。等長(zhǎng)至3片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株除去蛭石，在Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后進(jìn)行如下處理：低溫處理，將棉苗浸泡于Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液中，4 ℃培養(yǎng)；干旱處理，將棉苗浸泡于含有200 g/L PEG的Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液中；鹽脅迫處理，將棉苗浸泡于含有200 mmol/L Nacl的Hongland’s營(yíng)養(yǎng)液中；ABA處理，用1 mmol /L ABA噴施棉花葉片。取樣時(shí)間點(diǎn)為0、1、3、6、12、24和48 h，取樣后迅速用液氮冷凍并于-80 ℃保存，備用。

1.2 基因全長(zhǎng)的克隆

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)的特異引物GhPAO3-S 和GhPAO3-A(表1)，以棉花‘新陸早33號(hào)’cDNA為模板，擴(kuò)增基因全長(zhǎng)。擴(kuò)增體系：cDNA模板(20 ng/μL)1 μL，引物(10 μmol/L)1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.6 μL，Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，TaqBuffer 2 μL，加水至20 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠回收目的片段，回收后的產(chǎn)物連接Peasy-Blunt載體，轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)，將其涂于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆，在含卡那霉素的液體培養(yǎng)基過(guò)夜揺菌，菌液PCR驗(yàn)證，提取質(zhì)粒PCR并酶切驗(yàn)證是否插入目的片段，將陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 所用引物

1.3 生物信息學(xué)分析

采用Clustal軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，ORF finder在線預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框，MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_Sopm.html)軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成。

1.4 RNA提取與cDNA檢測(cè)

‘新陸早33號(hào)’不同組織和不同處理的試驗(yàn)材料經(jīng)液氮處理后，根據(jù)改良CTAB法提取總RNA，RNA提取后用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄酶Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄，取1 μg總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，體系中RNA 1 μg，Oligo dt(T18)1 μL，加DEPC水補(bǔ)至12 μL，70 ℃保溫10 min后，于冰上迅速急冷2 min，離心5 s，然后加入RNA變性液12 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Rnase Inhibitor 0.5 μL，Rnase M-MLV 1 μL，補(bǔ)水至20 μL，42 ℃保溫1 h，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻，-20 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用內(nèi)參基因檢測(cè)。

1.5 表達(dá)分析

設(shè)計(jì)GhPAO3基因GhPAO3-F、GhPAO3-R和內(nèi)參GhUBI-F、GhUBI-R基因?qū)崟r(shí)熒光引物(表1)，采用改良CTAB法提取不同組織和不同處理下棉花葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Real-time PCR 對(duì)GhPAO3基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。反應(yīng)體系為10 μL：(2×)SYBR Primix ExTaqTM5 μL，GhPAO3-F和GhPAO3-R(10 μmol/L)各0.5 μL，模板1 μL，無(wú)菌水3 μL，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhPAO3基因cDNA序列的克隆

以擬南芥(AtPAO5)基因的cDNA為序列探針，在雷蒙德氏棉數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn檢索，獲得一個(gè)陸地棉的同源基因，命名為GhPAO3。以陸地棉‘新陸早33號(hào)’的cDNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，獲得序列全長(zhǎng)為1 736 bp的DNA片段(圖1)，切膠后利用DNA回收試劑盒純化目的片段，并連接至Peasy-Blunting載體，在LB固體培養(yǎng)基挑陽(yáng)性單克隆，將質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切酶切鑒定，將質(zhì)粒送公司測(cè)序。通過(guò)ORF Finder在線軟件預(yù)測(cè)，GhPAO3具有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(圖2)，ORF全長(zhǎng)1 530 bp，編碼506個(gè)氨基酸。

圖1 GhPAO3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 棉花 GhPAO3基因cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 GhPAO3的蛋白生物信息學(xué)分析

運(yùn)用ProtParam軟件分析該蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明，GhPAO3的蛋白分子式為C2549H3933N683O756S20，分子質(zhì)量為56.88 ku，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為51，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為63，等電點(diǎn)為5.77，脂肪指數(shù)為84.11，該蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)為37.97，屬于穩(wěn)定蛋白，蛋白質(zhì)疏水性平均值是-0.223，屬于親水性蛋白。利用SOPMA軟件對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲4種組成，其中α-螺旋包含188個(gè)氨基酸，約占36.94%，延伸直鏈包含93個(gè)氨基酸，約占18.27%，β-轉(zhuǎn)角包含59個(gè)氨基酸，約占11.59%，無(wú)規(guī)則卷曲包含169個(gè)氨基酸，約占33.20%，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

2.3 GhPAO3蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

在NCBI中對(duì)BlastpGhPAO3基因編碼的氨基酸序列與其他同源性較高的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(圖3)和多重比對(duì)(圖4)。結(jié)果表明，GhPAO3與可可樹(shù)TcPAO5同源性最高，為72.60%，與葡萄VvPAO5的同源性達(dá)到64.83%，與模式植物擬南芥AtPAO5的同源性為61.62%。

圖3 GhPAO3與同源基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖4 不同植物PAO氨基酸序列比對(duì)

2.4GhPAO3基因在不同組織中的表達(dá)情況

以Real-time PCR對(duì)GhPAO3基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，GhPAO3基因在不同組織中的表達(dá)情況存在差異，在葉中表達(dá)量最高，達(dá)到根和莖表達(dá)量的3倍以上?；ò旰妥臃恐械谋磉_(dá)量較低，雌蕊和種子中的表達(dá)量最低，基本不表達(dá)(圖5)。

圖5 GhPAO3的組織表達(dá)分析

2.5 非生物脅迫下GhPAO3基因的表達(dá)分析

利用Real-time PCR分析GhPAO3基因在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)特性，從圖6可以看出，低溫處理3 h時(shí)基因表達(dá)量開(kāi)始升高，處理6 h 時(shí)迅速上升并達(dá)到最大值，達(dá)到未處理前的21倍以上，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)基因表達(dá)量下降(圖6-A)。PEG處理后，基因的表達(dá)量迅速上升，1 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到0 h的3倍多，之后表達(dá)量下降，并在處理12 h時(shí)表達(dá)量再次迅速上升，達(dá)到最大值后下調(diào)(圖6-B)。NaCl處理后，表達(dá)量在1 h時(shí)開(kāi)始上升，處理3 h時(shí)達(dá)到最大值，是未處理前的10倍以上，此后下降，并在處理12 h時(shí)再次上升，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量減弱(圖6-C)。ABA 處理時(shí)表達(dá)量先上升后下降，并在處理6 h時(shí)急劇上升至最大值，是未處理前的6倍以上，之后下降(圖6-D)。表明該基因受低溫、PEG、NaCl和ABA誘導(dǎo)表達(dá)，但表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，GhPAO3可能以不同的角色參與抵御上述非生物脅迫過(guò)程。

圖6 不同脅迫處理?xiàng)l件下 GhPAO3基因的表達(dá)分析

3 討論與結(jié)論

本研究從陸地棉中克隆獲得多胺氧化酶基因GhPAO3，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和多重序列比對(duì)分析表明，GhPAO3與TcPAO5、VvPAO5及AtPAO5同源性較高，而與克隆獲得的GhPAO1[15]和GhPAO2[16]同源性較低。Real-time PCR分析表明，GhPAO3基因在棉花葉片中的表達(dá)量最高，與Fincato等[12]通過(guò)GUS融合擬南芥PAO5在子葉中表達(dá)量高的結(jié)果相似，表明不同物種中同源PAO基因可能具有相似的組織表達(dá)模式。另一方面，大量研究[17-18]表明，多胺能夠提高植物抵御逆境脅迫的能力。本研究中棉花幼苗經(jīng)低溫、PEG和NaCl處理后GhPAO3表達(dá)量短時(shí)間內(nèi)均有顯著地提高，表明該基因在非生物脅迫處理?xiàng)l件下受到誘導(dǎo)表達(dá)，可能通過(guò)改變植物體內(nèi)多胺和H2O2含量以應(yīng)對(duì)外界生長(zhǎng)條件的變化[4，19-21]。此外，外源ABA處理棉花幼苗后GhPAO3基因在處理6 h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量，表明GhPAO3基因可能通過(guò)ABA信號(hào)途徑響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程[22]。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Cloning and Expression Analysis of Polyamine Oxidase (GhPAO3) Gene in Cotton (GossypiumhirsutumL.)

CHENG Xinqi,ZHU Xuefeng,CHENG Wenhan,HE Xue,SUN Jie and ZHU Huaguo

(The Key Laboratory of Oasis Eco-agriculture of Xinjiang Production and Construction Corps,College of Agronomy,Shihezi University,Shihezi Xinjiang 832003,China)

A homologous polyamine oxidase (PAO) gene was cloned through blastingAtPAO5cDNA in Raymond’s cotton genome database.A newPAOwas identified using RT-PCR and was named asGhPAO3in upland cotton.The full length ofGhPAO3cDNA was 1 736 bp,including a 1 530 bp open reading frame,encoding 506 amino acid residues,and the molecular weight of predicted protein was 56.88 ku,isoelectric point was 5.77.Expression pattern ofGhPAO3was analyzed in different tissues and treatments using real-time PCR.The results suggested that the order of expression level ofGhPAO3was leaf> stem> root> petal> ovary> stamen> seed> pistil.Besides,expression levels ofGhPAO3were significantly changed under different treatments.Expression level ofGhPAO3reached the highest level at 6 h under low temperature and ABA treatment,whereas the highest expression level ofGhPAO3occurred at 3 h and 24 h under NaCl and PEG treatments,respectively.These results indicated thatGhPAO3is induced by abiotic stresses，and will play an important role in defending against abiotic stress in cotton.

Cotton; Cloning; Polyamine oxidase; Abiotic stress

CHENG Xinqi,male,master student.Research area:seed biology and germplasm innovation.E-mail:360028055@qq.com

ZHU Huaguo,male,associate professor.Research area:plant biotechnology.E-mail:zhgroger@sohu.com

2015-11-23

2016-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31301363);兵團(tuán)科技攻關(guān) (2014BA004);石河子大學(xué)動(dòng)植物育種專項(xiàng)(gxjs2013-yz02)。

成新琪，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉N子科學(xué)與技術(shù)。E-mail:360028055@qq.com

朱華國(guó)，男，副教授，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。E-mail:zhgroger@sohu.com

日期：2016-10-20

Q966

A

1004-1389(2016)10-1472-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.016.html

Received 2015-11-23 Returned 2016-01-14

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31301363); Corps Technological Program(No.2014BA004); Animal and Plant Breeding Program(No.gxjs2013-yz02).