王姍姍，鄭永富，馬夢婷，高慶華,3，韓春梅,3

(1. 塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300；2. 塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

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馬鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化過程表面標(biāo)志物的特征性變化

王姍姍1，鄭永富1，馬夢婷2，高慶華1,3，韓春梅1,3

(1. 塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300；2. 塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

利用阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、茜素紅染色和免疫組化法鑒定鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)不同分化階段蛋白多糖、Ca2+和Ⅱ型膠原蛋白3種軟骨細(xì)胞表面標(biāo)志物的分泌量。結(jié)果表明，誘導(dǎo)第14～21 天細(xì)胞蛋白多糖分泌逐漸增加，阿利新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果逐漸達(dá)強(qiáng)陽性，至第28 天時蛋白多糖胞外積累量開始下降；茜素紅染色與免疫組化結(jié)果顯示，誘導(dǎo)第14～35 天，細(xì)胞陽性結(jié)果均逐漸上升，第35 天茜素紅染色與免疫組化檢測陽性結(jié)果顯著高于前3個階段。表明：體外誘導(dǎo)鹿茸MSCs至第14 天軟骨細(xì)胞開始出現(xiàn)，并分泌蛋白多糖和少量Ⅱ型膠原蛋白，第21 天軟骨細(xì)胞大量出現(xiàn)，開始分泌少量Ca2+，至第28 天時軟骨開始向骨分化，蛋白多糖分泌下降，Ca2+在胞外積累，第35 天軟骨細(xì)胞完成終末分化進(jìn)入鈣化期。

鹿茸；間充質(zhì)干細(xì)胞；軟骨分化；體外誘導(dǎo)；表面標(biāo)記

成體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是目前備受關(guān)注的具有可塑性的成體干細(xì)胞。研究[1-2]表明MSCs具有可塑性好、永生化但癌變幾率小、易定向誘導(dǎo)分化等優(yōu)點，從組織分離的MSCs在體外定向誘導(dǎo)下可分化為靶組織細(xì)胞并維持其增殖能力，使其在應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。鹿茸MSCs是新發(fā)現(xiàn)的一類成體干細(xì)胞，由角柄骨膜發(fā)育而來，細(xì)胞呈梭形，含有單個呈橢圓型的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)含量較少，核較大，是軟骨內(nèi)骨化模式的細(xì)胞儲備層[3-4]。鹿茸軟骨細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，細(xì)胞核仁不明顯，其增殖、骨化與鹿茸的快速生長密切相關(guān)[5-7]。鹿茸從萌發(fā)到骨化的過程中伴隨著2種成骨模式：膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)骨化。膜內(nèi)成骨主要發(fā)生在初角茸形成和角柄萌發(fā)的階段，軟骨內(nèi)骨化主要發(fā)生在鹿茸角縱向快速增長期[6-8]。鹿茸的軟骨內(nèi)骨化與人長骨發(fā)育模式十分相似，均是由間充質(zhì)干細(xì)胞密集分化為軟骨細(xì)胞進(jìn)而分化成骨細(xì)胞[9]。因此，鹿茸是骨生理及骨醫(yī)學(xué)研究的理想模型。

軟骨細(xì)胞在形成的過程中，能夠分泌Ⅱ型膠原(ColⅡ)和蛋白多糖2類細(xì)胞表面標(biāo)志物。膠原纖維的生物成分是膠原蛋白，類型多達(dá)26種，其中ColⅡ僅分布于軟骨組織。ColⅡ使軟骨組織具有一定的張力和硬度，同時是軟骨細(xì)胞分泌的特征性基質(zhì)。研究[10-11]表明，體外培養(yǎng)數(shù)周的軟骨細(xì)胞具備分泌ColⅡ基質(zhì)的能力，但是在傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞開始表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型膠原，并喪失分泌軟骨基質(zhì)的能力；蛋白多糖是一種黏性的膠凍分子，極親水性，使軟骨組織富含水分而具有高度的張力和彈性以抵抗壓力，大多數(shù)蛋白多糖分子以高分子聚合體的形式存在，即以透明質(zhì)酸為核心再連接多種成分而組成。軟骨中的蛋白多糖以硫酸軟骨素4、6和硫酸角質(zhì)素為主。對豬不同組織的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，第3代以后的細(xì)胞分泌蛋白多糖的量顯著下降。軟骨膠原蛋白和蛋白多糖作為軟骨的連接蛋白和基質(zhì)蛋白，是評價軟骨細(xì)胞功能的重要指標(biāo)[10]。目前，軟骨細(xì)胞鑒定最簡單可靠的方法是免疫組化法和甲苯胺藍(lán)等染色法。免疫組化法是通過抗原抗體特異性結(jié)合檢測軟骨細(xì)胞分泌的ColⅡ；甲苯胺藍(lán)和阿利新藍(lán)染料可與細(xì)胞分泌的帶有特殊化學(xué)基團(tuán)的蛋白多糖結(jié)合而顯色，因此可鑒定軟骨細(xì)胞分泌的帶有羧基(COOH)和硫酸基(OSO3H)的蛋白多糖；茜素紅染料與細(xì)胞分泌的Ca2+螯合產(chǎn)生紅色復(fù)合物，因此可檢測細(xì)胞外Ca2+的沉積量。體外誘導(dǎo)軟骨分化是骨生理代謝研究的主要方式。

本試驗采用4種軟骨鑒定方法(甲苯胺藍(lán)、阿利新藍(lán)、茜素紅染色和ColⅡ免疫組化法)，檢測鹿茸MSCs軟骨分化不同階段的軟骨細(xì)胞表面標(biāo)志物，比較表面標(biāo)志物的變化差異，觀察分析鹿茸MSCs軟骨分化過程中不同細(xì)胞的功能和生理特征，研究其軟骨內(nèi)骨化模式特點，為鹿茸軟骨生化特性及鹿茸快速生長和再生的研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

馬鹿茸MSCs(P2，塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點試驗室提供)，DMEM 低糖培養(yǎng)基(Thermo)、胎牛血清( FBS，Gibco)、青霉素鈉(80萬單位)、鏈霉素鈉(100萬單位)、TGF-β1(Peprotech)、阿利新藍(lán)(Amresco)、甲苯胺藍(lán)(Amresco)、茜素紅S(Amresco) 、膠原蛋白Ⅱ型多克隆抗體(Boster)、免疫組化染色試劑盒(Boster)、DAB顯色試劑盒(Boster)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞誘導(dǎo) 取凍存的第2代馬鹿茸MSCs，37 ℃水浴融化后離心，調(diào)整密度后接種到6孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后，將培養(yǎng)MSCs的培養(yǎng)基(含雙抗和φ=10%FBS的DMEM)換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有10 ng/mL TGF-β1、地塞米松、抗壞血酸的完全培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d半量換液1次。

1.2.2 誘導(dǎo)過程表面標(biāo)志物的鑒定 分別取誘導(dǎo)組第7、14、21、28和35 天的細(xì)胞，每組3個重復(fù)孔。吸去培養(yǎng)基，加入PBS沖洗3次，最后加入φ=4%的多聚甲醛于4 ℃過夜固定，之后分別用阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、茜素紅染色法和免疫組化法進(jìn)行鑒定。檢測方法按試劑盒說明進(jìn)行。顯微鏡下觀察拍照后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 染色和免疫組化結(jié)果根據(jù)許良中等[12]對免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計。每個階段每種檢測法設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)選擇6個顯微鏡視野進(jìn)行觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)的評分采用H-seore法，H-score為染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞百分比得分的和。陽性細(xì)胞百分比分成5級：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。著色強(qiáng)度分4級：無色為0分，淡染色為1分，深染色為3分，介于兩者之間為2分。最終H-score評分結(jié)果是：0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～5分為陽性(+)，6～7分為強(qiáng)陽性(++)，其中陽性和強(qiáng)陽性均判為陽性。數(shù)據(jù)利用SPSS17.0統(tǒng)計分析,用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)分化不同階段4種方法的檢測

2.1.1 阿利新藍(lán)染色 由圖1可知，鹿茸MSCs體外誘導(dǎo)第7 天時，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形，僅有細(xì)胞核發(fā)生藍(lán)染，胞質(zhì)未被染色，說明無陽性細(xì)胞(圖1-A)；誘導(dǎo)第14 天和21 天時，陽性細(xì)胞呈三角形，其細(xì)胞核、胞質(zhì)及胞外基質(zhì)均觀察到明顯藍(lán)染(圖1-B～1-C)。隨著誘導(dǎo)天數(shù)至第28和35 天時，更多細(xì)胞呈三角形變化，可觀察到藍(lán)染的胞核，但胞質(zhì)藍(lán)染強(qiáng)度減弱，胞外基質(zhì)完全不被染色(圖1-D～1-E)。

2.1.2 甲苯胺藍(lán)染色 誘導(dǎo)后細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果見圖2。誘導(dǎo)第7 天細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)被藍(lán)染未出現(xiàn)異染。在誘導(dǎo)第14 天時，陽性細(xì)胞呈區(qū)域化的異染，胞質(zhì)呈藍(lán)紫色。在誘導(dǎo)第21 天時，全部細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，胞質(zhì)異染呈藍(lán)紫色，異染效果較誘導(dǎo)14 d的細(xì)胞更為明顯。觀察誘導(dǎo)第28天和35 天的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度降低，細(xì)胞不完整率增加，部分細(xì)胞發(fā)生胞質(zhì)內(nèi)異染。

2.1.3 茜素紅染色 誘導(dǎo)后細(xì)胞的茜素紅染色結(jié)果見圖3。誘導(dǎo)第7 天細(xì)胞的胞質(zhì)和胞外基質(zhì)均未觀察到陽性反應(yīng)(圖3-A)。在誘導(dǎo)第14 天時，僅在細(xì)胞外基質(zhì)中觀察到少量出現(xiàn)紅色Ca2+結(jié)節(jié)物(圖3-B)。此后，細(xì)胞質(zhì)和胞外基質(zhì)出現(xiàn)紅色染色顆粒和結(jié)節(jié)物隨誘導(dǎo)時間的延長而增多，且分布均勻廣泛(圖3-C～3-D)。在誘導(dǎo)第35 天時，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中大量的紅色晶體顆粒和成片結(jié)節(jié)物，紅色染色較深(圖3-E)。

2.1.4 免疫組化 誘導(dǎo)后細(xì)胞的免疫組化結(jié)果見圖4。誘導(dǎo)過程ColⅡ的陽性反應(yīng)與茜蘇紅染色結(jié)果相似。誘導(dǎo)第7 天細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和胞外基質(zhì)完全沒有被染色，反應(yīng)為陰性(圖4-A)。隨著誘導(dǎo)時間的延長，陽性細(xì)胞質(zhì)和胞外基質(zhì)中被染色強(qiáng)度增加。在誘導(dǎo)第14 天時，少量陽性細(xì)胞胞質(zhì)和外基質(zhì)均被染色呈淡黃色(圖4-B)。誘導(dǎo)第21 、28和35 天，75%以上的細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，胞質(zhì)內(nèi)及外基質(zhì)被染色呈棕黃色(圖4-C～4-E)。

圖1 阿利新藍(lán)染色鑒定(×100)

圖2 甲苯胺藍(lán)染色鑒定(×100)

2.2 軟骨細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定

由表1可知，4種方法中阿利新藍(lán)染色法最早檢測到鹿茸MSCs軟骨分化的表面標(biāo)志物-硫酸軟骨素蛋白多糖，甲苯胺藍(lán)染色是鑒定誘導(dǎo)第14 天的細(xì)胞，檢測到蛋白多糖。2種方法在第21 天陽性反應(yīng)最強(qiáng)，硫酸軟骨素等蛋白多糖分泌量達(dá)到最大。在隨后的反應(yīng)中陽性結(jié)果降低，說明隨誘導(dǎo)階段延長硫酸軟骨素蛋白多糖的分泌量逐漸下降。

茜素紅染色結(jié)果說明細(xì)胞在誘導(dǎo)第14 天后細(xì)胞開始分泌鈣離子，且分泌量與細(xì)胞誘導(dǎo)的時間呈正比；免疫組化法檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)第14 天的細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果呈弱陽性，表明細(xì)胞開始少量分泌Col Ⅱ。誘導(dǎo)第21、28和35 天的細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果呈陽性和強(qiáng)陽性，誘導(dǎo)第21 天后的細(xì)胞大量分泌Col Ⅱ，且分泌量隨著誘導(dǎo)時間的增加而增加，在誘導(dǎo)第35 天時分泌量達(dá)到最大。

圖3 茜素紅染色鑒定(×100)

圖4 免疫組化法鑒定(×100)

表1 4種方法檢測不同誘導(dǎo)階段細(xì)胞的陽性結(jié)果統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

3.1 鹿茸MSCs軟骨分化過程蛋白多糖分泌的變化特征

現(xiàn)已證實軟骨細(xì)胞具有合成軟骨蛋白多糖基質(zhì)的能力。蛋白多糖由透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素或硫酸角質(zhì)素組成，為軟骨的特征分泌物[13]。本試驗結(jié)果表明，在鹿茸MSCs向軟骨細(xì)胞分化的過程中，誘導(dǎo)第14天的細(xì)胞能夠分泌少量的蛋白多糖。羅斯敏[14]利用人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)體外誘導(dǎo)軟骨分化，通過Realtime PCR檢測細(xì)胞蛋白多糖mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)12 d細(xì)胞的表達(dá)量最大，這與本試驗阿利新藍(lán)染色結(jié)果相似；滕勇等[15]體外誘導(dǎo)人骨髓MSCs軟骨分化時，使用甲苯胺藍(lán)染色鑒定，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)15 d的細(xì)胞染色呈陽性結(jié)果，與本試驗第14天的鑒定結(jié)果一致。

試驗結(jié)果得到關(guān)于蛋白多糖分泌量和胞外積累量的特點，誘導(dǎo)第14～21天細(xì)胞的阿利新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色情況發(fā)現(xiàn)，呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞由之前的聚集區(qū)細(xì)胞擴(kuò)大到全部細(xì)胞。且隨分化形成軟骨細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞表面標(biāo)志物的分泌量逐漸增加，且在胞外的積累量達(dá)到最大。該結(jié)果與謝永輝[16]研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)軟骨分化的試驗結(jié)果一致。該過程完全符合人長骨軟骨內(nèi)骨化的特征：MSCs先發(fā)生聚集現(xiàn)象，之后再開始向軟骨分化。

細(xì)胞在誘導(dǎo)28 d以后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞數(shù)量開始逐漸下降，細(xì)胞開始出現(xiàn)衰老、破損和死亡等現(xiàn)象。阿利新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色的陽性結(jié)果也開始下降。一方面，胞外蛋白多糖的積累量下降可能與軟骨細(xì)胞的生理變化有關(guān)。茜素紅檢測誘導(dǎo)28 d后細(xì)胞Ca2+的分泌，表示細(xì)胞開始進(jìn)入骨分化期，此時軟骨細(xì)胞分泌蛋白多糖的能力下降。此外透明質(zhì)酸酶等降解酶對胞外基質(zhì)中蛋白多糖有降解作用，也可導(dǎo)致細(xì)胞外蛋白多糖的量開始下降；另一方面，胞外蛋白多糖的積累量下降與細(xì)胞生長狀況相關(guān)。誘導(dǎo)后期因為空間等外界因素的影響，細(xì)胞出現(xiàn)破損死亡，相應(yīng)胞外基質(zhì)中蛋白多糖會被加速降解[17-19]。

3.2 鹿茸MSCs軟骨分化過程ColⅡ和Ca2+分泌變化特征

羅斯敏[14]通過Realtime PCR檢測ADSCs成軟骨分化，結(jié)果表明誘導(dǎo)至21 d細(xì)胞的Col Ⅱ mRNA的表達(dá)量達(dá)高峰，而后Col Ⅱ mRNA的表達(dá)量下降，且誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞開始分泌Ca2+。本試驗結(jié)果表示，在鹿茸MSCs誘導(dǎo)過程中14 d的細(xì)胞開始分泌Col Ⅱ，表示誘導(dǎo)14 d的細(xì)胞已是具有分泌基質(zhì)功能的軟骨細(xì)胞。該結(jié)果與阿利新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果一致。誘導(dǎo)28 d的細(xì)胞外出現(xiàn)鈣螯合物，表明28 d的細(xì)胞有肥大成熟向骨細(xì)胞分化的趨勢，誘導(dǎo)35 d時完成終末分化進(jìn)入鈣化期，這與羅斯敏的研究結(jié)果十分相似。

本試驗結(jié)果表明，鹿茸軟骨胞外膠原的積累量與誘導(dǎo)時間呈正相關(guān)，該結(jié)果與其他研究成體MSCs軟骨分化的試驗結(jié)果一致[20-22]。研究表明膠原前體的分泌途徑和腺細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)途徑完全一樣，翻譯后的新生肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上加工轉(zhuǎn)運修飾，最后由高爾基體運送到胞外形成不溶性膠原。膠原是一種具有剛性的纖維狀蛋白，其半衰期較長，正常情況下膠原在形成后不易降解，在軟骨細(xì)胞外形成一定空間結(jié)構(gòu)，既維持軟骨組織結(jié)構(gòu)又保護(hù)軟骨組織，即使分泌量下降，但是胞外的積累量會持續(xù)增加[17-18]。只有在細(xì)胞處于異常情況，如軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞死亡時，周圍組成會產(chǎn)生膠原酶對膠原進(jìn)行降解。

通過10 ng/mL TGF-β1體外誘導(dǎo)鹿茸MSCs，利用阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、茜素紅染色和免疫組化4種方法檢測軟骨表面標(biāo)志物變化，認(rèn)為誘導(dǎo)14 d的鹿茸MSCs進(jìn)入鹿茸軟骨細(xì)胞期，維持2周后軟骨分化完成，至誘導(dǎo)第28 天時軟骨細(xì)胞進(jìn)入骨細(xì)胞分化。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Analysis of Cell Surface Markers in Differentiation of Antler Mesenchymal Stem Cells into Chondrocytes in Vitro

WANG Shanshan1,ZHENG Yongfu1,MA Mengting2,GAO Qinghua1,3and HAN Chunmei1,3

(1. Institute of Animal Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China; 2.College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China; 3.The Key Laboratory of Animal Science and Technology in Tarim Xinjiang Production and Construction Corps,Alar Xinjiang 843300,China)

Used four methods of alcian blue,toluidine blue,alizarin red staining and immunohistochemistry,three cells’ surface markers,including Proteoglycans,Ca2+and Col Ⅱ,were identified on the 14th,21st,28th and 35th d mesenchymal stem cells(MSCs) by stimulating using growth factor beta1 (TGF-β1,10 ng/mL) in vitro. Alcian blue staining and toluidne blue staining revealed heavy positive staining in the cellular matrix from the 21th d,while its accumulations decreased after 28th d. By two methods of alizarin red staining and immunohistochemical staining,the amount of positive cells increased gradually from the 14th d to 28th d in the cartilage differentiation process. While results of the other stages showed significant difference. In conclusion,during the cartilage differentiation process,antler MSCs began to differentiate to secrete protein polysaccharide and a small amount of Col Ⅱ after induction for 14th d. After the 28th d osteogenic differentiation of antler cartilage cells began to be detect when protein polysaccharide decreased. After 21th d the cartilage cells began to secrete a small amount of Ca2+,amount of Ca2+has accumulated in the extracellular along with the induction time. Antler MSCs were induced to terminally differentiate after 35th d.

Antle; Mesenchymal stem cells; Chondrogenesis; Induction in vitro; Surface markers

WANG Shanshan ,female,master student. Research area:animal genetics and breeding.E-mail: wangshan1801640@163.com

HAN Chunmei,female,Ph.D,professor. Research area:animal genetics and breeding. E-mail:chunmeihan224@163.com

2015-11-15

2016-03-13 基金項目：國家自然科學(xué)基金(31260541)；新疆自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目(XJGRI2014141)。

王姍姍，女，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：wangshan1801640@163.com

韓春梅，女，博士，教授，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：chunmeihan224@163.com

日期：2016-10-20

S825

A

1004-1389(2016)10-1458-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.012.html

Received 2015-11-15 Returned 2016-03-13

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31260541);Xinjiang Uygur Autonomous Region Graduate Research and Innovation Project(No.XJGRI2014141).