馮帥帥，雒志新，閆 強, 徐 坤，王善禾，邵斯旻，張智英， 王 昕

(西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

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靶向敲除絨山羊lnc15479的CRISPR/ Cas9構(gòu)建及活性驗證

馮帥帥，雒志新，閆 強, 徐 坤，王善禾，邵斯旻，張智英， 王 昕

(西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

為研究生長期和休止期lnc15479的差異表達在陜北白絨山羊毛囊周期性發(fā)育中的作用及功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在lnc15479的上、下游各設計1個sgRNA靶位點，構(gòu)建CRISPR/cas9表達載體；并基于SSA修復機制，分別構(gòu)建含有紅色和綠色熒光標記的雙熒光報告載體系統(tǒng)。通過將表達載體和報告載體共同轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞，檢測該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率。結(jié)果表明，lnc15479的CRISPR/Cas9表達載體成功構(gòu)建，根據(jù)紅色和綠色熒光表達情況及細胞計數(shù)的方法，該系統(tǒng)的工作效率約為20%。研究結(jié)果為進一步分析lnc15479的功能提供技術(shù)支持。

CRISPR/Cas9；絨山羊；lncRNA

羊絨由于其纖維具有輕、柔、暖等特點，被譽為“纖維寶石”和“軟黃金”，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟價值。羊絨是由次級毛囊產(chǎn)生的，其生長是一個動態(tài)循環(huán)過程，包括生長期、退行期和休止期[1]。長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNA，lncRNAs)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA，能夠在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種水平上調(diào)控基因的表達[2- 3]。前期對陜北白絨山羊羊絨生長期和休止期皮膚組織的RNA-seq結(jié)果分析表明，lnc15479在生長期和休止期顯著差異表達，q-PCR結(jié)果表明該lncRNA在生長期的表達量比休止期高13.98倍(未發(fā)表數(shù)據(jù))，推測其可能對羊絨的周期性生長具有調(diào)控作用。

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9)是繼ZFN、TALEN之后的第3代基因組定點編輯技術(shù)，來源于簡單的細菌免疫系統(tǒng)，經(jīng)過人為改造后，可在真核細胞中實現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可通過直接合成、體外轉(zhuǎn)錄和載體表達等多種方式引入與靶序列堿基配對的特異性向?qū)NA(Single guide RNA，sgRNA)序列，從而引導Cas9蛋白結(jié)合到靶序列處，行使DNA切割功能，然后利用細胞的非同源性末端連接或同源重組修復機制對斷裂的DNA進行插入、缺失、修復或替換[4]，進而實現(xiàn)對多基因、多位點的打靶，甚至是基因組中大片段的刪除。CRISPR/Cas9技術(shù)目前廣泛應用于各種動物[5-8]、植物[9-11]、微生物[12]和病毒[13-14]的基因組編輯研究。

由于lncRNA不具有編碼的外顯子，短片段的缺失或插入可能不改變lncRNA的功能，因此，傳統(tǒng)方法很難實現(xiàn)對lncRNA的敲除。CRISPR/Cas9 技術(shù)具有易操作、設計簡單、能夠特異地靶向目標序列，實現(xiàn)大片段的靶向敲除，本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立lncRNA的靶向敲除系統(tǒng)，為后續(xù)研究lnc15479在羊絨周期性生長調(diào)控中的作用機制提供技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細胞株和質(zhì)粒 HEK293T細胞和DH5α感受態(tài)細胞均為陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室保存；質(zhì)粒PX330、pcDNA3.1、pPRIME-CMV-dsRed-recipent和p156RRL-EF1a-GFP-U3H1SatA購自Addgene公司。

1.1.2 材料和試劑 陜北白絨山羊皮膚組織樣由榆林學院提供，限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、ApaⅠ、NotⅠ、XmaⅠ、NarⅠ、KpnⅠ)、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、buffer、dNTPs均購自NEB公司，蛋白酶K購自Calbiochem公司，氨芐青霉素、瓊脂糖、Tris、SDS、EDTA購自上海生工生物工程有限公司，蛋白胨、酵母提取物購自Sigma公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Promega公司，膠純化試劑盒購自QIAGEN公司，Sofast轉(zhuǎn)染試劑購自廈門太陽馬生物工程有限公司。

1.1.3 引物合成和測序 所用引物序列見表1，引物合成及測序均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

表1 引物序列信息

1.2 方 法

利用在線軟件(http://crispr.mit.edu)在絨山羊lnc15479的上、下游各設計1個sgRNA靶位點，分別記為Target1(ATTAGCCCTTAACCTCCCCC)和Target2(CAGGGGAGTCTGGTCAACCT)，構(gòu)建敲除lnc15479(1 083 nt)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，并在HEK293T細胞中驗證其活性。

1.2.1 構(gòu)建表達載體 msgRNA-2 設計含有sgRNA靶位點Target1的引物F1和R1，并且在引物兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點。以pX330質(zhì)粒載體為模板，分別以F1和R1為上、下游引物進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，得到含有雙酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ的Target1.sgRNA序列；同樣的方法以F2和R2為引物得到含有雙酶切位點XhoⅠ和XbaⅠ的Target2.sgRNA序列。PCR體系：10×buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，模板1 μL，DNA聚合酶0.5 μL，引物(F+R) 1 μL(10 μmol/L)，補水至50 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以pcDNA3.1為母載體，分別進行雙酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)、(EcoRⅠ/XhoⅠ)、(XhoⅠ/XbaⅠ)后，將上一步得到的目的片段與載體pcDNA3.1于4 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，氨芐抗性平板篩選，挑取單克隆、搖菌、提取質(zhì)粒。測序驗證含有CD40.shRNA[15]、Target1.sgRNA和Target2.sgRNA序列的載體，命名為msgRNA-2(pcDNA3.1(+)-U6-Target1.sgRNA-CD40.shRNA-Target 2.sg RNA)(圖1)。

1.2.2 構(gòu)建雙熒光報告載體 以pPRIME-CMV-dsRed-recipent為模板，F(xiàn)3和R3為引物進行PCR擴增，得到含雙酶切位點XmaⅠ和NarⅠ的CMV-dsRed序列；以p156RRL-EF1a-GFP-U3H1SatA為模板，F(xiàn)4和R4為引物進行PCR擴增，膠回收得到含有酶切位點XbaⅠ的EF1a + 5′GFP，同樣的方法以F5和R5為引物得到含有酶切位點KpnⅠ的3′GFP序列。PCR條件：10×buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，模板1 μL，DNA聚合酶0.5 μL，引物(F+R)1 μL，補水至50 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

圖1 CRISPR/Cas9表達載體示意圖

以EF1a + 5′GFP和3′GFP為模板，F(xiàn)4和R5為引物，利用重疊PCR擴增得到帶有雙酶切位點XbaⅠ和KpnⅠ的EF1a-GFP完整序列。重疊PCR條件：10×buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，模板(EF1a + 5′GFP和3′GFP)1 μL，DNA聚合酶0.5 μL，引物(F4+R5)1 μL，補水至50μL。擴增程序同“F3和R3擴增程序”。

以pcDNA3.1為母載體，分別利用雙酶切(XmaⅠ/NarⅠ)和(XbaⅠ/KpnⅠ)進行膠回收，4 ℃過夜連接，將CMV-dsRed和EF1a-GFP連接到載體pcDNA3.1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，氨芐抗性平板篩選，挑取單克隆，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒并測序驗證，得到載體pcDNA3.1-CMV-DsRed-EF1a-GFP.BS.with repeats。

分別以等量的F6和R6、F7和R7為引物，利用PCR(單鏈退火形成雙鏈)擬合得到含有雙酶切位點NotⅠ和BamHⅠ的Target1序列和Target2序列。PCR條件：引物(F+R) 2 μL，10×buffer 1 μL，補水至10 μL。程序：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，-1 ℃/s降溫至25 ℃。

以質(zhì)粒pcDNA3.1-CMV-DsRed-EF1a-GFP.BS.with repeats為載體骨架，雙酶切(NotⅠ/BamHⅠ)后連接、轉(zhuǎn)化，氨芐抗性平板篩選，挑取單克隆，提取質(zhì)粒并測序驗證，最終分別得到含有Target1和Target2序列的雙熒光報告載體，命名為pcDNA3.1-CMV-DsRed-EF1a-Target1.GFP.BS.with repeats和pcDNA3.1-CMV-DsRed-EF1a-Target2.GFP.BS.with repeats。報告載體工作原理見圖2。

圖2 雙熒光報告載體原理

1.2.3 細胞培養(yǎng) HEK293T細胞培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基(含φ=10%胎牛血清)、L-glutamine、丙酮酸鈉。37 ℃、φ=5% CO2恒溫培養(yǎng)。

1.2.4 在HEK293T細胞中檢測CRISPR/Cas9活性 將HEK293T細胞在12孔板上培養(yǎng)至融合度達60%～70%左右時，采用Sofast轉(zhuǎn)染試劑推薦體系，將CRISPR/Cas9表達載體分別與雙熒光報告載體共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，同時轉(zhuǎn)染無sgRNA的空CRISPR/Cas9表達載體和報告載體為空白對照。轉(zhuǎn)染10 h后更換培養(yǎng)液。48 h后，在倒置熒光顯微鏡下檢測熒光表達情況。紅色熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，綠色熒光檢測CRISPR/Cas9的工作效率。

將CRISPR/Cas9表達載體和對應的報告載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達的嵌合型sgRNA引導Cas9酶作用于報告載體的靶點，產(chǎn)生DSB，刺激細胞利用單鏈退火的機制修復報告載體，修復過程將刪除靶序列，同時也恢復GFP基因的開放閱讀框，細胞表現(xiàn)為GFP陽性。因此，HEK293T細胞共轉(zhuǎn)染表達載體和報告載體后，在熒光顯微鏡下通過細胞計數(shù)的方法觀察GFP陽性細胞的比率，間接反應CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割靶序列的效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9真核表達載體及報告載體的構(gòu)建

構(gòu)建的表達載體msgRNA-2分別利用BamHⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定，分別得到5 660和105 bp、5 653和112 bp的目的條帶(圖3-A和3-B)，經(jīng)測序進一步驗證，與預期結(jié)果一致，表明表達載體構(gòu)建成功。由于相對應的雙熒光報告載體插入的目的片段只有20 bp，因此對其進行測序驗證(圖3-C)，經(jīng)序列比對后，結(jié)果正確，表明報告載體構(gòu)建成功。

圖3 CRISPR/Cas9表達載體與報告載體的鑒定

2.2 CRISPR/Cas9在哺乳細胞中的活性檢測

將構(gòu)建好的表達載體和報告載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，通過在熒光顯微鏡下觀察紅色和綠色熒光來判斷CRISPR-cas9系統(tǒng)是否工作。紅色熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，綠色熒光指示載體工作效率。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察到細胞中綠色熒光微弱，但已經(jīng)可以觀察到綠色熒光。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，試驗組均檢測到綠色熒光表達(圖4)，證明CRISPR/Cas9在HEK293T細胞中工作。通過對綠色熒光細胞進行計數(shù)，與對照組細胞相比較，該系統(tǒng)的工作效率約為20%。

圖4 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞后的熒光表現(xiàn)

3 討 論

陜北白絨山羊羊絨的生長具有明顯的周期性變化，研究表明，多種調(diào)控因子參與這一過程，而且非編碼RNA對調(diào)控毛囊細胞的周期性發(fā)育、平衡毛囊的正常生長和毛發(fā)纖維形態(tài)等具有重要作用[16-19]。在哺乳動物細胞中，除1.5%～2.0%的基因編碼蛋白外，其他的都轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs, lncRNAs)、miRNA、piRNA及siRNA等。研究表明[20]，以miRNA為代表的非編碼RNA參與絨山羊的毛囊發(fā)育及羊絨的周期性生長過程，而關(guān)于lncRNAs調(diào)控毛囊發(fā)育的研究鮮見報道。由于許多l(xiāng)ncRNAs僅在特定的發(fā)育階段出現(xiàn)[21]，或具有組織特異性和細胞特異性[22]。前期對羊絨生長期和休止期皮膚組織通過RNA-seq技術(shù)獲得一些差異表達的lncRNA[23]。lnc15479作為羊絨生長期和休止期有極顯著差異的lncRNA，在羊絨生長期的表達量顯著高于休止期，對羊絨的周期性生長可能具有一定的調(diào)控作用，但作用機制目前仍不清楚。因此,本研究擬通過CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)對大片段lncRNA的敲除，為進一步研究lncRNA調(diào)控羊絨周期性生長的機制奠定基礎。

RNA干擾(RNAi)技術(shù)是通過外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)特異性地引起基因表達沉默，干擾序列可能隨機整合到基因組，而且整合位置對細胞的影響不確定，且對照較難控制，因此采用此方法無法實現(xiàn)對lncRNA的特異性敲除，進而研究其功能。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個由蛋白和核酸組成的蛋白核酸復合物，利用sgRNA對特定的DNA序列進行識別，進而介導Cas9蛋白對靶點序列進行切割[24]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢在于設計簡單、可針對不同的靶點設計sgRNA；而且CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)多位點、多基因的打靶?？赏ㄟ^直接合成、體外轉(zhuǎn)錄和載體表達等多種方式引入多個sgRNA，同時介導Cas9對不同靶序列的切割，進而實現(xiàn)多基因多位點打靶，甚至是基因組中大片段的刪除。研究[25]表明CRISPR/Cas9可以結(jié)合內(nèi)源性RNA，在活體細胞中通過內(nèi)源性RNA追蹤進行基因編輯。Cong等[26]和Mali等[24]發(fā)現(xiàn)位于同一條染色體上的2個sgRNA對DNA雙鏈進行操作時，在獲得定點突變的同時也存在DNA片段刪除的情況。Fujii等[27]成功獲得約10 kb的DNA片段刪除小鼠，并且成功繁育出下一代。但是關(guān)于CRISPR-cas9特異性敲除lncRNA的研究尚未見報道。本研究正是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)點，成功構(gòu)建靶向lnc15479進行大片段敲除的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，工作效率達到20%左右，為進一步研究lnc15479的功能提供技術(shù)支持。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Construction and Active Verification of lnc15479 Targeted Knockout System on Cashmere Goat by CRISPR/Cas9 Technology

FENG Shuaishuai, LUO Zhixin, YAN Qiang, XUN Kun, WANG Shanhe,SHAO Simin, ZHANG Zhiying and WANG Xin

(College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

In order to understand the function of lnc15479 in hair follicle periodic development, two sgRNA target sites in the upstream and downstream of lnc15479 were designed and the CRISPR/Cas9 expression vector was constructed. The double fluorescent reporter vector based on SSA repair mechanism was then constructed to detect the cleavage efficiency of CRISPR-cas9. The expression and report vectors were then co-transfected HEK293T cells to detect the work efficiency of CRISPR/Cas9. The results showed that CRISPR/Cas9 vector was successfully constructed and its cleavage efficiency was about 20% from the red and green fluoresence. The results would provide technical support for the further study on lnc15479.

CRISPR/Cas9; Cashmere goat; LncRNA

FENG Shuaishuai, male, master student. Research area:biotechnology and animal breeding. E-mail:972223216@qq.com

WANG Xin, female, professor. Research area:biotechnology and animal breeding. Email:wxwza@126.com

2016-05-19

2016-05-30

國家自然科學基金(31201769，31472068)。

馮帥帥，男，碩士研究生，研究方向為生物技術(shù)與動物育種。E-mail: 972223216@qq.com

王 昕，女，教授，研究方向為生物技術(shù)與動物育種。E-mail: wxwza@126.com

日期：2016-10-20

Q812

A

1004-1389(2016)10-1442-07

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.006.html

Received 2016-05-19 Returned 2016-05-30

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31201769,31472068).