孫 靜, 黃 勇

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中華鉤線蟲(chóng)的DNA條形碼研究及分類意義探討

孫 靜, 黃 勇

(聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東聊城252000)

海洋線蟲(chóng)是海洋底棲生物中數(shù)量上最豐富的類群, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。對(duì)海洋線蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定是線蟲(chóng)研究中最重要的工作之一。目前, 海洋線蟲(chóng)的鑒定主要采用形態(tài)學(xué)的分析方法, 但是這種方法往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 對(duì)于如此豐富的物種, 急需新的鑒定方法。作者以黃海潮間帶自由生活線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種——中華鉤線蟲(chóng) ()為例, 在形態(tài)學(xué)分類的基礎(chǔ)上, 將DNA條形碼技術(shù)引入線蟲(chóng)的鑒定中, 探討了線粒體細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基(mtCOI)基因序列、28S rDNA序列的D2D3區(qū)以及18S rDNA序列的部分序列作為DNA條形碼在中華鉤線蟲(chóng)中的適用性。結(jié)果表明, 18S rDNA序列可作為該種線蟲(chóng)的DNA條形碼, 為海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼研究提供了很好的借鑒。目前, 利用 DNA 條形碼技術(shù)對(duì)海洋線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定的報(bào)道在國(guó)內(nèi)還屬空白, 本研究將是海洋線蟲(chóng)分類學(xué)研究的很好補(bǔ)充。同時(shí), 對(duì)于了解該海域海洋線蟲(chóng)多樣性及群落分布格局, 開(kāi)展海洋環(huán)境監(jiān)測(cè), 進(jìn)而對(duì)海洋的底質(zhì)環(huán)境狀況進(jìn)行健康評(píng)價(jià)具有十分重要的科學(xué)意義。

中華鉤線蟲(chóng)(); 形態(tài)鑒定; DNA條形碼

海洋線蟲(chóng)是小型底棲生物的永久性成員。在大多數(shù)生境中, 海洋線蟲(chóng)是數(shù)量上最豐富的類群, 占后生動(dòng)物數(shù)量的70%~90%, 在某些生境中可達(dá)到90%以上[1]。海洋線蟲(chóng)還是海洋環(huán)境質(zhì)量的重要指示者, 可以依據(jù)其密度、種類組成、群落結(jié)構(gòu)變化對(duì)海洋底棲環(huán)境的健康狀況進(jìn)行診斷。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有越來(lái)越多的學(xué)者將海洋線蟲(chóng)和其他小型底棲生物作為海洋生態(tài)監(jiān)測(cè)評(píng)估體系的一個(gè)重要指標(biāo), 應(yīng)用于海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中[2-3]。

對(duì)海洋線蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定是線蟲(chóng)研究中最重要的工作之一。目前, 海洋線蟲(chóng)的鑒定主要是采用形態(tài)學(xué)的分析方法[4-5]。這種方法以線蟲(chóng)的形態(tài)特征和超微結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ), 運(yùn)用顯微鏡對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定, 是海洋線蟲(chóng)分類鑒定的基礎(chǔ)。但是全球海洋線蟲(chóng)的種類極其豐富, 約有十萬(wàn)種之多, 對(duì)于如此豐富的物種, 在進(jìn)行海洋線蟲(chóng)生物多樣性的大規(guī)模調(diào)查研究中, 短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定非常困難; 并且海洋線蟲(chóng)的外部形態(tài)因發(fā)育階段的不同常發(fā)生很大的變化, 給主要依據(jù)形態(tài)特征來(lái)鑒定的經(jīng)典分類工作帶來(lái)很大困難, 迫切需要新的研究手段。

DNA條形碼技術(shù)是實(shí)現(xiàn)快速鑒定的很好選擇。DNA條形碼通過(guò)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化、較短的基因片段序列變異來(lái)鑒定物種, 是近年來(lái)生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)展最迅速的前沿學(xué)科之一。該技術(shù)是傳統(tǒng)物種鑒定的強(qiáng)有力補(bǔ)充, 是分類學(xué)中輔助物種鑒定的新技術(shù), 它代表了生物分類學(xué)研究的一個(gè)新方向, 并為海洋生物的分類和鑒定提供了有力工具[6-8]等。

本研究探討了線粒體細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基(mtCOI)基因序列, 28S rDNA序列的D2D3區(qū)以及18S rDNA序列的部分序列作為DNA條形碼, 在中華鉤線蟲(chóng)中的適用性, 以期為其他海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼研究提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

沉積物樣品采自山東省煙臺(tái)市漁人碼頭(37°30′N, 121°26′E), 在沿岸及潮間帶進(jìn)行采樣。用小型生物取樣管采集定量樣品, 用等量5%()的甲醛溶液固定, 用于線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)分析。

1.2 線蟲(chóng)分選、制片和形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.1 分選

實(shí)驗(yàn)室用0.1%虎紅染色24 h, 然后用過(guò)濾后的自來(lái)水沖洗, 使樣品通過(guò)500 μm和31 μm的兩層網(wǎng)篩, 對(duì)截留在31 μm網(wǎng)篩上的沉積物樣品, 用比重為1.15的Ludox-TM溶液轉(zhuǎn)移到離心管中, 攪拌均勻, 以1 800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。離心3次后, 將所得的上清液再通過(guò)31 μm的網(wǎng)篩, 過(guò)濾掉Ludox, 然后用蒸餾水把樣品轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。向盛有線蟲(chóng)的胚胎培養(yǎng)皿中加入一定量的甘油酒精水混合液(5%︰5%︰90%), 放入干燥箱。兩周后, 酒精和水揮發(fā), 甘油滲入蟲(chóng)體, 使線蟲(chóng)身體透明, 便于觀察鑒定。

1.2.2 制片

在備好的干凈載玻片上, 滴甘油一滴, 挑選直徑大小一致的線蟲(chóng), 轉(zhuǎn)移至甘油中。選取直徑與蟲(chóng)體直徑大致相同的玻璃珠3粒, 均勻放于甘油滴的邊緣, 然后加蓋蓋玻片, 周邊用加拿大樹(shù)膠封閉, 貼標(biāo)簽后置于干燥箱中, 待樹(shù)膠干涸后即可觀察。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

在微分干涉顯微鏡下進(jìn)行觀察和測(cè)量, 依據(jù)線蟲(chóng)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定[5]。

1.3 DNA條形碼分析

1.3.1 DNA提取

形態(tài)學(xué)鑒定完畢, 用滅菌的解剖刀移去蓋玻片, 將單條線蟲(chóng)分別移至0.5 mL PCR管中, PBS緩沖液洗滌兩次, 提取線蟲(chóng)DNA[9]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

分別選取針對(duì)mtCOI基因、28S rDNA的D2D3區(qū)以及18S rDNA的引物進(jìn)行擴(kuò)增[9-11], 引物序列如表一所示。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.3.3 構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載海洋線蟲(chóng)18S rDNA序列, 用Clustal X軟件比對(duì)序列, 之后用Mega 5.05構(gòu)建NJ樹(shù)(Bootstrap設(shè)置為1000)。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

中華鉤線蟲(chóng)(圖1)是中國(guó)海洋大學(xué)張志南教授于1983年發(fā)表的中國(guó)自由生活海洋線蟲(chóng)研究的第一個(gè)新種。雄體長(zhǎng)2 010~2 770 μm, 最大體寬38~42 μm。體表光滑無(wú)裝飾, 具縱向排列的短的體剛毛。頭部圓盾, 內(nèi)唇感覺(jué)器乳突狀, 外唇感覺(jué)器剛毛狀, 與4條頭剛毛排列成一圈, 為6+10模式, 長(zhǎng)約6 μm?？谇惠^大, 深24~26 μm, 內(nèi)具3個(gè)角質(zhì)化的齒, 其中左亞腹齒較大, 右亞腹齒和背齒較小?；衅鞔? 7~8 μm寬, 位于背齒齒尖處。排泄孔位于頭端后約120 μm處的腹面。神經(jīng)環(huán)位于整個(gè)咽的中部; 咽管圓柱狀, 末端稍膨大, 與腸相連,長(zhǎng)約占體長(zhǎng)的16%。尾錐柱狀, 末端稍膨大成棒狀, 長(zhǎng)90~94 μm, 約為肛部體寬的3.4~4倍。尾腺細(xì)胞位于肛前身體的后端。

兩條交接刺等長(zhǎng), 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 稍彎曲, 近端頭狀,遠(yuǎn)端尖, 中后部稍膨大, 長(zhǎng)約為肛部體寬的1.2倍。無(wú)引帶。具一顯著的肛前肉質(zhì)突起; 尾的中后部腹側(cè)有一肛后乳突, 上有2對(duì)長(zhǎng)約3 μm的剛毛。除尾部亞背側(cè)剛毛外, 還有約11對(duì)長(zhǎng)5~9 μm的環(huán)肛剛毛。

雌體較雄體大, 長(zhǎng)3 380 μm, 最大體寬46 μm, 尾長(zhǎng)134 μm, 為肛部體寬的4.8倍。具一前置, 反折狀的卵巢, 雌孔開(kāi)口于身體的中后部的腹面, 距頭端距離約為體長(zhǎng)的67%處。

1-1. 雄體前端, 示口腔、大的左亞腹齒和小的背齒; 1-2. 雌體頭端, 示頭剛毛、口腔、小的右亞腹齒和背齒; 1-3. 雄體尾端, 示交接刺、肛前乳突; 1-4. 雄體尾端, 示環(huán)肛剛毛和尾部乳突

1-1. Lateral view of male head end showing buccal cavity, large left subventral tooth, and small dorsal tooth; 1-2. Lateral view of female head end showing cephalic setae, buccal cavity, small right subventral tooth, and dorsal tooth; 1-3. Lateral view of male tail end showing spicules and precloacal papillae; 1-4. Lateral view of male tail end showingcircumanal setae and tail papillae

該線蟲(chóng)廣泛分布于青島、煙臺(tái)、威海、日照等海濱潮間帶有機(jī)質(zhì)豐富的泥沙質(zhì)沉積物中, 為個(gè)體較大的優(yōu)勢(shì)種。

2.2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)

中華鉤線蟲(chóng)的COI基因及28S rDNA序列D2D3區(qū)的PCR未得到目的片段(COI基因擴(kuò)增產(chǎn)物呈彌散狀, 而28S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物有非特異性擴(kuò)增), 僅18S rDNA序列PCR取得了比較好的結(jié)果, 擴(kuò)增片段的大小為345 bp。從圖2可見(jiàn), 線蟲(chóng)DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到了一條特異性條帶(泳道最前端為引物二聚體), 說(shuō)明該對(duì)引物具有較好的特異性。

2.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的sp.(序列號(hào) AY854196)進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)序列相似度為96.2%, 有13個(gè)堿基的差異(332/345)(圖3)。從系統(tǒng)樹(shù)可以看出(圖4), 中華鉤線蟲(chóng)與sp.聚為一支, 通過(guò)分析可以確定中華鉤線蟲(chóng)的種屬關(guān)系, 達(dá)到鑒定的目的。由此可見(jiàn), 該18S rDNA片段可以作為DNA條形碼用于鑒定該種線蟲(chóng)。

M. DL2000; 1. 陰性對(duì)照; 2.3.

M. DL2000; 1. Negative control; 2.3.

3 討論

本研究的主要目的是以中華鉤線蟲(chóng)為例, 探討DNA條形碼技術(shù)在海洋線蟲(chóng)鑒定中的應(yīng)用, 以期為海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼研究提供方法借鑒。

一般來(lái)講, 進(jìn)行分子生物學(xué)方面的研究, 要將海洋線蟲(chóng)進(jìn)行乙醇固定。雖然這種固定方法便于進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增等分析, 但也存在一定的弊端, 線蟲(chóng)的某些表面特征會(huì)變得不容易識(shí)別, 進(jìn)而影響形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性。所以本研究采用甲醛固定線蟲(chóng), 便于進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析, 同時(shí)對(duì)線蟲(chóng)的DNA提取方法進(jìn)行了改進(jìn)。甲醛固定線蟲(chóng)的DNA提取關(guān)鍵在于裂解時(shí)間的控制, 在按照試劑盒DNeasy Tissue Kit (Qiagen Inc, Crawley, UK)操作的基礎(chǔ)上, 將裂解時(shí)間延長(zhǎng)至96 h[9], PCR模板的量增至5~15 μL,可以成功擴(kuò)增出目的片段。該提取方法對(duì)甲醛固定及存檔的小型底棲生物標(biāo)本, 進(jìn)行分子鑒定和種群遺傳分析提供了很好的解決方法。

在本研究中, 中華鉤線蟲(chóng)的COI基因及28S rDNA序列D2D3區(qū)的PCR, 經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系及退火溫度的優(yōu)化, 并未擴(kuò)增出目的片段。以往研究曾指出, 這兩個(gè)基因作為海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼并不具有較高的適用性。COI基因的M1-M6區(qū)常作為DNA條形碼的標(biāo)志性基因用于物種鑒定, 但是Derycke[10]認(rèn)為I3-M11更適合用作海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼, 兩個(gè)片段的擴(kuò)增效率比分別為87.8%和65.8%。但是本研究中采用了Derycke[10]設(shè)計(jì)的JB3(F)、JE5(R)和JB2(F)、JB5GED(R)兩對(duì)擴(kuò)增效率最高的引物, 擴(kuò)增條帶均呈彌散狀且無(wú)法進(jìn)行克隆測(cè)序。據(jù)研究, 28S rDNA序列D2D3區(qū)的擴(kuò)增效率也僅為62%[12]和67%[13]左右, 并且該對(duì)引物不適用于中華鉤線蟲(chóng)(有非特異性擴(kuò)增)。同時(shí), 經(jīng)福爾馬林固定的樣品, 會(huì)對(duì)線蟲(chóng)的DNA造成一定的損壞, 使DNA片段化并直接影響DNA的提取效率, 這也是本研究未成功獲取中華鉤線蟲(chóng)的COI基因及28S rDNA序列D2D3區(qū)的主要原因。最終結(jié)果表明, 18S rDNA可以作為有效的條形碼對(duì)中華鉤線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定。該基因包含保守區(qū)和高變區(qū), 便于進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 并且屬于多拷貝基因, 比起單拷貝的基因具有更高的擴(kuò)增效率[14]。

因此, 海洋線蟲(chóng)條形碼的研究首先要找到一個(gè)合適的基因區(qū)域或者基因組合; 其次, 要建立一個(gè)地理區(qū)域范圍廣泛的序列庫(kù), 以便進(jìn)行海洋線蟲(chóng)多樣性和進(jìn)化關(guān)系的分析。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 推動(dòng)了越來(lái)越多的公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank, EMBL, DDBJ, BOLD等)的建立, 這其中收錄了不少生物的條形碼信息, 為海洋線蟲(chóng)的條形碼研究提供了序列基礎(chǔ)。但是基因區(qū)域的選擇在海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼研究中一直存在爭(zhēng)議?；谝酝难芯堪l(fā)現(xiàn), COI基因[10, 15]、28S序列的D2D3區(qū)[13]以及18S區(qū)序列[16-17]均被認(rèn)可作為海洋線蟲(chóng)DNA條形碼使用, 用于海洋線蟲(chóng)鑒定; 也有的學(xué)者建議多個(gè)基因片段組合使用(核基因和線粒體基因)將會(huì)取得更好的結(jié)果[15]。

目前國(guó)內(nèi)研究主要是種類調(diào)查、種群結(jié)構(gòu)以及監(jiān)測(cè)潮間帶有機(jī)質(zhì)污染等方面, 并且大多都是基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究, 這就需要大批海洋線蟲(chóng)專家, 但效率低下, 且數(shù)據(jù)整合也比較困難。因此, 分子生物學(xué)的鑒定方法可以對(duì)海洋線蟲(chóng)進(jìn)行高效鑒定和分類[11, 18-19], 進(jìn)而加速中國(guó)海區(qū)自由生活線蟲(chóng)分類、區(qū)系研究、多樣性調(diào)查及新種的發(fā)掘, 為中國(guó)海洋生物資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。盡管海洋線蟲(chóng)的DNA條形碼研究在中國(guó)還處于起步階段, 但隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的完善和分析技術(shù)的發(fā)展, 基于DNA條形碼的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的海洋生物多樣性監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)定性、定量分析將成為可能[20]。新興的DNA條形碼技術(shù)將為中國(guó)海洋生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)、海洋生物多樣性保護(hù)以及海洋生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展提供強(qiáng)有力的支撐[21]; 這將是海洋線蟲(chóng)分類學(xué)研究的很好補(bǔ)充, 在我國(guó)海洋線蟲(chóng)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文編輯: 譚雪靜)

DNA barcoding analysis and taxonomic significance of the marine nematode

SUN Jing, HUANGYong

(School of Life Sciences, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

Marine nematodes are the most dominant and diverse meiofaunal group in marine benthic habitats. They are important to the functioning of estuarine and marine ecosystems. Identification of marine nematodes is one of the most significant aspects in their study. Nematode diagnostics has traditionally relied on detailed morphological examination that requires specialist taxonomic expertise. Given their abundance, morphological taxonomy is time consuming and laborious. The primary purpose of this study was to identifyZhang & Platt, 1983, using standard taxonomic approaches and DNA barcoding. Here, we describe the identification ofZhang & Platt, 1983, using the mitochondrial cytochrome oxidase c subunit (COI) gene, 28S sequences (D2D3 domain), and a short stretch of 18S rRNA sequence. Our results indicated that 18S rRNA sequence may be better suited for DNA barcoding of, providing a reference for barcoding marine nematodes. DNA barcodes provide powerful tools for rapid species identification and can be quickly applied in ecological studies on marine nematodes. DNA barcoding analysis of marine nematodes has not yet been reported in China. This study would be a good supplement to identification of marine nematodes. This would be of great significance to the assessment of nematode diversity and regional community distribution, monitoring of marine environment, and status evaluation of marine sediments.

Marine nematode; morphological identification; DNA barcoding

Feb. 26, 2015

Q7

A

1000-3096(2016)09-0039-06

10.11759//hykx20150226001

2015-02-26;

2015-04-23

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014DM008); 聊城大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目(3180500)

孫靜(1981-), 山東聊城人, 講師, 主要從事海洋生物學(xué)研究, E-mail: mythcherry@163.com.; 黃勇, 通信作者, 教授, E-mail: huangy@lcu.edu.cn

[Foundation: The Science Foundation of Department of Science and Technology of Shandong Province, No. ZR2014DM008; The Doctoral Program Foundation of Liaocheng University, No. 3180500]