張 瑞, 闕華勇, 叢日浩, 李 莉, 張國范

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海灣扇貝維甲酸受體(RXR) cDNA克隆與表達分析

張 瑞1, 2, 闕華勇1, 叢日浩1, 李 莉1, 張國范1

(1. 中國科學院海洋研究所, 山東青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

維黃酸受體(RXR)是核受體超家族的重要成員, 已有研究表明其在脊椎動物中廣泛參與調(diào)控生長發(fā)育、新陳代謝等多種重要的生理過程。本研究采用 RACE 技術(shù)克隆獲得海灣扇貝() RXR (AiRXR) cDNA序列, 采用熒光定量RT-PCR 技術(shù)分析該基因在性腺發(fā)育不同時期的不同組織中的表達特點。結(jié)果表明, AiRXR的cDNA序列開放閱讀框為1338bp, 含有兩個亞型: AiRXRα和AiRXRβ, 兩個亞型之間在T-box中相差4個氨基酸。該蛋白序列與人 () 和櫛孔扇貝 () 等的RXR相似性很高。AiRXR進化樹分析顯示, AiRXR與軟體動物RXR聚為一支。AiRXR基因具有廣泛的組織表達特點, 在檢測的組織中(外套膜、鰓、性腺、閉殼肌)均有表達, 推測AiRXR以信號分子的形式參與多種組織細胞的生命過程; 在海灣扇貝性腺發(fā)育過程中AiRXR基因在性腺發(fā)育的各時期均有表達且增殖期表達量最高, 說明AiRXR基因可能參與調(diào)節(jié)性腺發(fā)育和分化的過程。

海灣扇貝(); RXR基因; 組織表達; 性腺發(fā)育

核受體超家族是一大類組成型的轉(zhuǎn)錄因子, 能夠調(diào)控多種代謝途徑如胚胎發(fā)育、內(nèi)環(huán)境和生理的穩(wěn)態(tài)[1]。維甲酸X受體 (RXR) 作為核受體超家族中的一員, 含有5個典型的核受體結(jié)構(gòu)域: A/B、C、D、E和F。A/B結(jié)構(gòu)域中含有活性的配體非依賴性的轉(zhuǎn)錄激活域 (AF-1), 能夠增強E結(jié)構(gòu)域中AF-2的作用, 從而上調(diào)靶基因的表達。C結(jié)構(gòu)域中含有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域中含有兩個鋅指結(jié)構(gòu), 能夠介導核受體與位于靶基因啟動子區(qū)域的特異順向重復序列(也稱反應元件)結(jié)合。D結(jié)構(gòu)域是鉸鏈結(jié)構(gòu)域, 含有一個相對保守的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (LBD), 可以與配體結(jié)合, 改變蛋白結(jié)構(gòu)進而誘導基因表達, E區(qū)含一個配體依賴性的轉(zhuǎn)錄激活域 (AF-2), 它能傳遞配體結(jié)合信號, 控制配體依賴的轉(zhuǎn)錄和激活; F結(jié)構(gòu)域序列保守性很低, 具有較高的可變性[2-3]。在脊椎動物中, RXR分為三個亞型: α、β和γ, RXR作為轉(zhuǎn)錄因子與其他核受體成員如蛻皮激素受體(EcR)、視黃酸受體 (RAR)、過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR) 形成二聚體結(jié)合靶基因參與胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、新陳代謝等多種重要的生理過程[4-6]。在無脊椎動物如海綿動物[7]、昆蟲[8]、甲殼動物[9]等類群中也克隆獲得RXR的同源基因序列。

海灣扇貝 (自然分布于美國的東海岸和墨西哥灣沿岸, 于1982年首次成功引入我國, 實現(xiàn)了苗種全人工培育, 帶動海灣扇貝成為我國主要海水養(yǎng)殖貝類之一[10]。性腺發(fā)育分為五個時期: 分化期、增殖期、成熟期、排放期和休止期[11-12]。親貝性腺發(fā)育的成熟度和同步性直接影響著苗種生產(chǎn)成敗, 但迄今對貝類性腺發(fā)育的分子調(diào)控機制知之甚少。本研究采用 RACE 技術(shù)克隆獲得海灣扇貝RXR cDNA序列并分析其結(jié)構(gòu), 采用熒光定量RT-PCR 技術(shù)分析該基因在性腺發(fā)育不同時期的不同組織中的表達特點, 旨在探究RXR基因在海灣扇貝發(fā)育過程中的調(diào)控作用, 為進一步開展雙殼類RXR的功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海灣扇貝樣品的獲取

海灣扇貝()取自青島市古鎮(zhèn)口灣, 在性腺發(fā)育的5個時期: 分化期、生長期、成熟期、排放期和休止期分別采集其鰓、性腺、外套膜、閉殼肌的組織樣品, 取樣后的組織置于–80℃冰箱中待用。

1.2 海灣扇貝RXR基因的克隆

采用Trizol 法提取海灣扇貝總RNA, 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 檢測提取的RNA 濃度。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan) 合成RACE cDNA 第一條鏈, 以此為模板進行PCR擴增。利用海灣扇貝轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)獲得RXR基因序列片段, 根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計引物: AiRXR-F和AiRXR-R, 凝膠電泳檢測條帶的大小, PCR反應體系為25 μL, 其中cDNA模板2 μL、EX-taq酶 (TaKaRa, Japan) 12.5 μL、滅菌水10 μL、引物各0.5 μL, PCR反應條件: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共35個循環(huán), 72℃延伸10 min。對該基因片段進行驗證后, 設(shè)計RACE引物。采用巢式PCR擴增得到海灣扇貝 RXR cDNA的全長, RXR基因的全長所用引物見表1。PCR反應體系25 μL, 其中cDNA模板2 μL、LA-taq酶 (TaKaRa, Japan) 12.5 μL、滅菌水10 μL、引物各0.5 μL, PCR反應條件: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共35個循環(huán), 72℃延伸10 min。擴增并純化后連接到pEASY-T1 載體(北京全式金生物技術(shù)公司)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans-T1 感受態(tài)細胞 (北京全式金生物技術(shù)公司)中, 涂平板, 37℃培養(yǎng)過夜, 挑取抗氨芐青霉素的陽性克隆, 經(jīng)菌液PCR檢測后, 交由北京六合華大股份有限公司進行測序。

1.3 RXR基因序列分析及系統(tǒng)進化分析

運用ORF finder (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/) 預測克隆基因的開放閱讀框 (ORF), 在NCBI Genbank BLAST (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov/genbank/) 尋找與海灣扇貝RXR的同源序列, 通過CLUS-TALW (http: //www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/) 進行多序列同源比對, 并用BioEdit軟件分析。根據(jù)在線BLASTp(http: //blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast)對蛋白結(jié)構(gòu)進行預測, 利用MEGA軟件 (http: //www.megasoftware.net)中的最大似然法對預測RXR的DBD和LBD的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建進化樹。

1.4 海灣扇貝各組織RXR基因的表達

利用ABI 7500 Fast 熒光定量PCR儀, 分析海灣扇貝RXR (RXR, AiRXR) 在海灣扇貝性腺發(fā)育5個時期不同組織中的定量表達, 每個樣本做3 個平行檢測。已有的研究表明, RXR的異構(gòu)體在組織的表達沒有明顯的差異[13], 因此在海灣扇貝RXR cDNA的保守區(qū)設(shè)計熒光定量PCR的引物: AiRXR-DOU-F和AiRXR-DOU-R(表1)。熒光定量RT-PCR 反應條件: 94℃ 30s, 1個循環(huán); 94℃ 5s, 60℃ 30s, 40個循環(huán)。通過ABI 7500 Fast SDS software V2.0 軟件輸出數(shù)據(jù), 采用2–DDCt法對基因的相對表達量進行分析, 18S rRNA 作為內(nèi)參基因。使用EXCEL軟件進行統(tǒng)計分析(0.05)。

表1 引物序列

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 海灣扇貝RXR基因的cDNA 克隆

克隆擴增得到AiRXR的cDNA含有兩個亞型: AiRXRα和AiRXRβ, 異構(gòu)體中長度最短的AiRXRα編碼序列1338bp, 編碼446個氨基酸, 理論的等電點為6.89, 軟件預測蛋白為49.10 ku (http: //web. expasy.org/compute_pi/), AiRXRβ在AiRXRα的T-box 區(qū)域A 和V之間插入了4個氨基酸 (CLAA)。氨基酸序列比對顯示AiRXR含有典型的RXR家族結(jié)構(gòu)即含有兩個保守的蛋白結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (LBD), DBD中含有P-BOX (EGCGK) 和D-BOX (CREER)。D區(qū)存在T-box (EAVQEERQR), E結(jié)構(gòu)域中AF-2可激活RXR的轉(zhuǎn)錄活性(圖1)。

2.2 同源序列分析和進化樹分析

將克隆得到的AiRXR的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域分別與人 ()、斑馬魚 ()、小鼠()、爪蟾 () 和櫛孔扇貝 () 等13個物種的22個 RXR氨基酸的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域進行同源比對, 發(fā)現(xiàn)AiRXRα和AiRXRβ與人和爪蟾的同源性均為79%~84%, 與櫛孔扇貝RXR的同源性高達90% (圖2)。

(, 光滑雙臍螺, AAL86461)、(, 招潮蟹, AAC32789)、(, 大型蚤, ABF74729)、(, 斑馬魚, NP_571228)、(, 斑馬魚, NP_571313)、(, 斑馬魚, NP_001002345)、(, 陸地蟹, AAZ20368)、(, 人, ABB96254)、(, 人, AAA60293)、(, 人, AAA80681)、(, 東亞飛蝗, AAQ55293)、(, 靜水椎實螺, AAW34268)、(, 小鼠, NP_035435)、(, 大西洋犬峨螺, ABS70715)、(, 大西洋犬峨螺, ABS70716)、(, 荔枝螺, AAU12572)、(, 爪蟾, P51128)、(, 爪蟾, NP_001080936)、(, 爪蟾, NP_001088948)、(, 櫛孔扇貝, AFL91696.1)、(, 櫛孔扇貝, AFL91697.1)、(, 櫛孔扇貝, AFL91698.1)、-(, 櫛孔扇貝, AFL91699.1)。P-box、D-box、T-box和AF-2用框架標記

利用MEGA5.0軟件對AiRXR與其他13個物種的RXR的DBD和LBD部分結(jié)構(gòu)域構(gòu)建進化樹, 發(fā)現(xiàn)AiRXR與櫛孔扇貝RXR聚在一起, 并與其他軟體動物聚為一大支, 與脊椎動物RXR分離開, 說明AiRXR屬于RXR家族成員, 并且序列相對保守(圖3)。

GenBank accession number:(AAL86461)、(AAC32789)、(ABF74729)、(NP_571228)、(NP_571313)、(NP_001002345)、(AAZ20368)、(ABB96254)、(AAA60293)、(AAA80681)、(AAQ55293)、(AAW34268)、(NP_035435)、(ABS70715)、(ABS70716)、(AAU12572)、(P51128)、(NP_001080936)、(NP_001088948)、(AFL91696.1) 、(AFL91697.1) 、(AFL91698.1)、(AFL91699.1)。海灣扇貝RXR用框架標記

2.3 海灣扇貝RXR在性腺不同發(fā)育時期各組織中的表達

熒光定量PCR用于檢測AiRXR在性腺不同發(fā)育時期的表達, 結(jié)果表明, AiRXRα與AiRXRβ mRNA在性腺發(fā)育的五個時期: 分化期、增殖期、成熟期、排放期和休止期中均有表達, 但在性腺增殖期表達量最高(<0.05)。在性腺發(fā)育時期, AiRXR在組織中的表達差異顯著(<0.05); 在發(fā)育時期的性腺組織中, AiRXR在增殖期的表達量最高, 并在成熟期、排放期和休止期中表達量迅速下降 (圖4)。

3 討論

本研究首次克隆獲得海灣扇貝RXR基因(AiRXR)的cDNA 序列, 發(fā)現(xiàn)其含有2個RXR亞型: AiRXRα和AiRXRβ, 蛋白預測表明兩個異構(gòu)體之間插入一個相差12個核苷酸的T-box (+4)。在腹足類軟體動物如[14]和[4]中也發(fā)現(xiàn)了相似的RXR的異構(gòu)體。對其進行蛋白保守區(qū)預測, 顯示其具有RXR核受體家族蛋白所具有的A-F區(qū)域的完整結(jié)構(gòu)。從N 端到C 端, 海灣扇貝RXR氨基酸序列的C 區(qū)存在高度保守的P-box和D-box兩個典型的結(jié)構(gòu), 其中P-box主要參與特異性結(jié)合DNA, D-box與同型二聚體的形成有關(guān)。D 區(qū)存在參與DNA 識別的T-box, 由于AiRXRα和AiRXRβ在T-box相差4個氨基酸序列, 因此AiRXRα和AiRXRβ在識別靶基因的位置存在差異。E/F結(jié)構(gòu)域中的AF-2能夠傳遞配體結(jié)合信號, 控制配體依賴的轉(zhuǎn)錄和激活[15]。

在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)RXR與9-順式維甲酸 (9cRA) 有較高的親和力, 參與調(diào)控維甲酸信號途徑, 并且在腹足類動物、和中也發(fā)現(xiàn)RXR可與9cRA結(jié)合[14, 16], 因此推測9cRA可能與AiRXR結(jié)合。目前已發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的三丁基錫(TBT) 能夠與人的RXR(hRXR)結(jié)合, 結(jié)合位點位于9cRA結(jié)合區(qū); 疣荔枝螺()的RXR(TcRXR)與hRXR的LBD有相似的空間結(jié)構(gòu), 因此推測軟體動物中TBT可能與TcRXR結(jié)合[17-18]。采用熒光素酶雙報告技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)TcRXR對外界的TBT有響應[4]。AiRXR是否參與海灣扇貝的三丁基錫應激反應, 尚待進一步的實驗證實。

雙殼類貝類中存在多種性腺發(fā)育的途徑, 既有雌雄分化也有雌雄同體的形式, 由于性別分化的多樣性, 因此研究雙殼類性別分化和性別決定機制具有重要的價值[14]。本研究發(fā)現(xiàn)AiRXR在海灣扇貝性腺發(fā)育的5個時期均有表達并且在增殖期表達最高, AiRXR的表達趨勢與雜色鮑的RXR表達一致[19]。這一發(fā)現(xiàn)說明軟體動物RXR參與了細胞增值與分化的過程, 類似脊椎動物存在的作用[20], 而且也可據(jù)此推斷RXR在調(diào)節(jié)性腺發(fā)育的過程發(fā)揮了作用。AiRXR在性腺發(fā)育時期的各組織中均有表達, 且在性腺中表達較高, 為AiRXR可能參與調(diào)節(jié)性腺發(fā)育提供了進一步的證據(jù)。影響軟體動物性腺發(fā)育的溫度、餌料、水質(zhì)等生態(tài)環(huán)境因子是否會影響RXR的表達, RXR的表達調(diào)控作用與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性, 還有待進一步的研究[21-22]。

4 結(jié)論

本文報道了海灣扇貝RXR基因的cDNA序列及其在性腺發(fā)育不同時期的不同組織中的表達特點, 研究結(jié)果有助于闡明海灣扇貝性腺發(fā)育的分子機制, 豐富軟體動物繁殖生物學和水產(chǎn)養(yǎng)殖學的知識, 為軟體動物的性腺分化與發(fā)育分子機制的研究提供了重要的基礎(chǔ)資料。

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(本文編輯: 梁德海)

Molecular cloning and expression of the retinoid X receptorgene in

ZHangRui1, 2, QUE Hua-yong1, CONG Ri-hao1, LI Li1, ZHANG Guo-fan1

(1. Institute of Oceanology of the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The retinoid X receptor (RXR) is a member of the nuclear family of receptors. It has been proven that RXR plays a crucial role in regulating growth, development, metabolism, and other physiological process in vertebrates. Using the RACE technique, the cDNA sequence ofRXR (AiRXR) was cloned. The ORF of AiRXR was 1338 bp. Two isoforms were confirmed as AiRXRα and AiRXRβ with a difference of four amino acids in the T-box. The homologous analysis of the amino acids showed that AiRXRs share a high degree of similarity with the RXRs ofand. The results of qRT-PCR illustrated that the AiRXR genes are expressed in multiple tissues (mantles, gills, gonads, and adductor muscles) throughout gonadal development, indicating that AiRXRs act as one of the signal molecules involved in multiple physiological processes. The highest level of AiRXR expression was observed at the proliferation stage of gonadal development, implying that AiRXR may be involved in the regulation of gonadal development and differentiation.

; AiRXR gene; tissue expression; gonadal development

Jan. 24, 2016

Q786

A

1000-3096(2016)09-0001-08

10.11759/hykx20160408003

2016-01-24;

2016-06-15

國家科技部高技術(shù)研發(fā)計劃課題(863計劃, 2012AA10A410); 貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-48); 中國科學院科技服務網(wǎng)絡計劃項目(KFJ-EW-STS-060)

張瑞(1991-), 女, 滿族, 吉林人, 碩士研究生, 從事海洋生物功能基因研究, 電話: 0532-82898695, Email: 13069312160@163.com; 闕華勇, 通信作者, 研究員, E-mail: hque@qdio.ac.cn

[Foundation: The National High Technology Research and Development Program, 863 Program, No.2012AA10A410; The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-48; Science and Technology Service Network Initiative No.KFJ-EW-STS-060]