劉璨穎，徐卓菲，付 強(qiáng)

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程技術(shù)學(xué)院，佛山 528000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

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豬鏈球菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的原核表達(dá)、活性檢測和同源建模

劉璨穎1，徐卓菲2，付 強(qiáng)1

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程技術(shù)學(xué)院，佛山 528000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

旨在以豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)為藥靶，給S.suis病防治研制新型抗菌藥提供理論和試驗基礎(chǔ)。原核表達(dá)了S.suisHMGR，用Ni-NTA樹脂對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行了純化，并用分光光度法測定了其酶活力。此外，運(yùn)用CLUSTALW對同源HMGR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對。通過SWISS-MODEL對S.suisHMGR三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，并用PROCHECK評價模型的質(zhì)量。酶活力測定結(jié)果顯示，催化HMG-CoA還原為甲羥戊酸的反應(yīng)中，S.suisHMGR最佳反應(yīng)溫度和pH分別為37 ℃和5.0，其Vmax和Km為846 U·mg-1和0.213 mmol·L-1。經(jīng)分析顯示，肺炎鏈球菌HMGR晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：3QAE_A)是構(gòu)建S.suisHMGR三維結(jié)構(gòu)的最佳模板。構(gòu)建的三維結(jié)構(gòu)模型經(jīng)質(zhì)量評估證實(shí)為可靠的理論模型，將有助于虛擬篩選出對抗S.suis感染的新型抗生素，酶活力的測定為用試驗手段驗證S.suisHMGR抑制劑的有效性提供了可行性的方法。

鏈球菌；HMGR；原核表達(dá)；蛋白質(zhì)純化；酶活測定；同源建模

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種重要的人畜共患病原菌，能引起宿主廣泛的臨床疾病。豬感染S.suis后的臨床癥狀包括腦膜炎、肺炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、流產(chǎn)和膿腫等[1-6]。S.suis甚至可以引起接觸過感染豬或消費(fèi)生豬產(chǎn)品的成人全身性感染[7]。由于針對S.suis感染沒有合適的免疫接種措施，并且S.suis的耐藥性日益增加，通過疫苗和抗生素治療不能有效控制S.suis感染[8]。因此，急需從S.suis代謝通路中尋找新的靶標(biāo)并研制新型抗生素。

細(xì)菌中異戊二烯類分子具有許多重要的生物功能，其中包括涉及電子傳遞，作為細(xì)胞壁合成中的載體和參與產(chǎn)生抗生素形成競爭優(yōu)勢等。異戊二烯類分子由五碳前體異戊二烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)或其同分異構(gòu)體二甲基丙烯基磷酸衍生而來。合成IPP的途徑有兩種：甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸途徑[9-13]。甲羥戊酸途徑中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)催化HMG-CoA生成甲羥戊酸，是該途徑中關(guān)鍵的限速酶。D. A. Bochar等基于氨基酸序列分析認(rèn)為有兩種不同類HMGR。編碼I類HMGR的基因存在于所有的真核生物，許多古生菌和一些鏈霉菌屬中。而編碼II類HMGR的基因存在于一些真細(xì)菌和閃爍古生球菌中[14-16]。I類和II類HMGR有共同的催化機(jī)制，但是其三維結(jié)構(gòu)和對他汀類抑制作用的敏感性有顯著的差異[17-20]。在細(xì)菌中，W. Li等以肺炎鏈球菌II類HMGR為藥靶，用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選和試驗驗證，得到3個肺炎鏈球菌新型抗生素[21]。此外，E. I. Wilding等通過基因干擾試驗證實(shí)編碼II類HMGR的基因mvaA對金黃色葡萄球菌體外生長是必須的[14]。因此，細(xì)菌II類HMGR可以成為針對多耐藥性病原菌抗生素靶標(biāo)。

本研究成功原核表達(dá)、純化了豬鏈球菌HMGR，并測定其酶促動力學(xué)參數(shù)，此外，運(yùn)用同源建模設(shè)計了豬鏈球菌HMGR理論三維結(jié)構(gòu)模型，為今后虛擬篩選出對抗S.suis感染的HMGR抑制劑和運(yùn)用試驗驗證抑制劑的有效性奠定了理論和試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

豬鏈球菌SS2 SC-19菌株2005年分離于中國四川省流行病暴發(fā)時的一頭病豬[21]。感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21購自寶生物工程(大連)有限公司；原核表達(dá)載體pET-28a(含有His標(biāo)簽)購自Novagen公司。S.suis培養(yǎng)在添加了10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中。大腸桿菌培養(yǎng)在LB或LA培養(yǎng)基中。抗性篩選時，大腸桿菌培養(yǎng)在含有50 μg·mL-1卡那霉素的培養(yǎng)基中。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，TaqDNA聚合酶，T4 DNA連接酶，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，DNA marker DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)預(yù)染marker購自加拿大Fermentas公司；HMG-CoA購自sigma公司；DTT，新生牛血清購自四季青公司；NaCl，蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XXID公司；瓊脂粉購自武漢潔洋盛生物科技有限公司；TSB購自BD公司；DNA(膠)回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，Ni-NTA樹脂購自Qiagen公司。

1.3 引物設(shè)計與基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中登錄的S.suisBM407的mvaA基因序列(登錄號：YP_003029230.1)設(shè)計引物，上游引物：(5′-ATCGGGATCCATGTCAAC TTTTTCCGGATT-3′)和下游引物：(5′-GGCG CTCGAGGCCATCATGGATGTCTTTC-3′)，下劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物在上海生工生物技術(shù)有限公司合成。用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取豬鏈球菌SS2 SC-19菌株基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增mvaA基因，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min共35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸7 min。

1.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用BamHⅠ和XhoⅠ分別雙酶切原核表達(dá)載體pET-28a和回收的mvaA片段，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定。

1.5 重組HMGR蛋白的表達(dá)和純化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至上海生工生物有限公司測序后，利用測序結(jié)果在線NCBI Blastn比對GenBank數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，檢測序列的同源基因。取含有重組質(zhì)粒的BL21菌液接種到含有Kanamyci終濃度為50 μg·mL-1的LB液體培養(yǎng)基，180 r·min-137 ℃培養(yǎng)過夜。次日以1∶100體積比例接種到含有Kanamyci終濃度為50 μg·mL-1的LB液體培養(yǎng)基，200 r·min-137 ℃培養(yǎng)2.5 h，菌液OD值達(dá)到0.5～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol·L-1誘導(dǎo)HMGR蛋白表達(dá)。在180 r·min-137 ℃培養(yǎng)5 h后，菌液于4 ℃ 10 000 r·min-1離心2 min。沉淀用4 ℃裂解液(含有50 mmol·L-1磷酸鈉，0.3 mol·L-1NaCl，5 mmol·L-1DTT，10 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)重懸并高壓破碎，收集上清液并用SDS-PAGE檢測目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。用1 mLNi-NTA瓊脂糖柱純化HMGR重組蛋白。高壓破碎后收集的上清液加入Ni-NTA瓊脂糖柱，用4 ℃裂解液平衡。用5倍柱體積的洗滌液(含有50 mmol·L-1磷酸鈉，0.3 mol·L-1NaCl，5 mmol·L-1DTT，20 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)洗柱。用8 mL洗脫液(含有50 mmol·L-1磷酸鈉，0.3 mol·L-1NaCl，5 mmol·L-1DTT，250 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)洗脫Ni-NTA瓊脂糖柱上結(jié)合的重組HMGR蛋白。用生物分光光度計(Eppendorf)測量蛋白質(zhì)濃度。

1.6 HMGR活性測定

HMGR活性測定參照李鵬等報道的方法并加以改進(jìn)[22]。用BioTek分光光度計(Synergy, Gene Company limited)測定NAD(P)H在340 nm處吸光值的減少來檢測分析HMGR酶活力。標(biāo)準(zhǔn)的酶反應(yīng)體系(總體積為200 μL)包括0.25 mmol·L-1NADPH, 0.25 mmol·L-1HMG-CoA, 50 mmol·L-1NaCl, 1 mmol·L-1EDTA, 5 mmol·L-1DTT, 25 mmol·L-1KH2PO4(pH 6.5)和純化后的HMGR。反應(yīng)體積中加入HMG-CoA后，反應(yīng)開始。一個酶活力單位定義為每分鐘消耗2 μmol NADPH所需要的HMGR酶量。以未加IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞破碎上清液經(jīng)過同樣Ni-NTA柱純化處理后的液體作為陰性對照。

1.7 序列分析和同源建模

利用NCBI blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對S.suisHMGR氨基酸序列進(jìn)行序列比對分析和保守域預(yù)測。運(yùn)用CLUSTALW對球菌和博氏螺旋體中HMGR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，其中包括肺炎鏈球菌(GenBank登錄號EDK78539.1)，無乳鏈球菌(GenBank登錄號AKI57711)，釀膿鏈球菌(GenBank登錄號AKL62895.1)，豬鏈球菌(GenBank登錄號YP_003029230.1)，表皮葡萄球菌(GenBank登錄號KTF26195.1)，金黃色釀膿葡萄球菌(GenBank登錄號WP_001180324.1)，PseudomonasMevalonii(PDB登錄號4I6A_B)和博氏螺旋體(GenBank登錄號NP_212819.1)[23]。將S.suisHMGR氨基酸序列上傳至SWISS-MODEL在線服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org)進(jìn)行同源建模，獲得該蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)[24]。用PROCHECK評價所建模型的質(zhì)量[25]。

2 結(jié) 果

2.1 序列分析和同源建模

經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至公司測序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中mvaA基因與已報道的S.suismvaA基因(YP_003029230.1)核苷酸序列相似性為100%。鑒定正確的表達(dá)載體pET-HMGR轉(zhuǎn)化到E.coliBL21，用0.8 mmol·L-1IPTG于37 ℃誘導(dǎo)5 h。純化后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示出一條相對分子質(zhì)量約為46 ku的蛋白質(zhì)條帶(圖1)，與其理論值相符?？扇苄源痔崛∥镌诮?jīng)過Ni-NTA樹脂純化后的比活力為6.56 μmol·(min·mg)-1。

1. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo); 2. IPTG誘導(dǎo); 3. 表達(dá)產(chǎn)物上清; 4. 表達(dá)產(chǎn)物沉淀; 5. 純化后的重組HMGR蛋白; M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. Not induced with IPTG; 2. IPTG induction; 3. Supernatant of expression product; 4. Precipitate of expression product; 5. The purified recombinant HMGR protein; M. Protein molecular weight marker圖1 重組HMGR蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of the recombinant HMGR

2.2 HMGR的動力學(xué)特征

重組HMGR的酶活力測定基于分光光度計，檢測NADPH在340 nm處吸收值的變化。HMGR的最適反應(yīng)pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為37 ℃(圖2)。在催化HMG-CoA還原為甲羥戊酸的反應(yīng)中，HMGR的Vm和Km值分別為846 U·mg-1和0.213 mmol·L-1。

2.3 序列分析與同源建模

NCBI blastp分析顯示，S.suisHMGR氨基酸序列5—417區(qū)段屬于Class II HMGR (CDD ID：cd00644)。S.suisHMGR與肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、釀膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、金黃色釀膿葡萄球菌、PseudomonasMevalonii和博氏螺旋體中HMGR氨基酸序列相似性分別為60%、60%、59%、43%、44%、42%和33%。將S.suisHMGR和球菌、螺旋體HMGR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果如圖3。有研究Pseudomonasmevalonii

HMGR晶體結(jié)構(gòu)的報道揭示，其與底物HMG-CoA結(jié)合的保守序列為ENVIG(I)，與底物NAD(H)結(jié)合的保守序列為DAMGXN(II)和GTVGG(III)，這三段保守序列在圖3紅色方框中標(biāo)示出來[18]。

SWISS MODEL分析顯示肺炎鏈球菌HMGR的晶體結(jié)構(gòu)(PDB-ID: 3QAE-1A)是S.suisHMGR建模的最佳模板。SWISS MODEL服務(wù)器對S.suisHMGR建模的結(jié)果用二維圖像顯示見圖4。HMGR為對稱的二聚體結(jié)構(gòu)，SWISS MODEL顯示的為整體結(jié)構(gòu)。

用PROCHECK檢測S.suisHMGR三維模型的合理性，結(jié)果見圖5。圖5中拉馬錢德蘭(Ramachandran)圖統(tǒng)計表明在SWISS MODEL構(gòu)建的模型中，分別有91.8%氨基酸殘基的二面角落在最適宜區(qū)域(圖中紅色區(qū)域)，7.2%的氨基酸殘基的二面角落在其他的允許區(qū)域(圖中黃色區(qū)域)，0.6%的氨基酸殘基的二面角落在勉強(qiáng)的允許區(qū)域(圖中淺黃色區(qū)域)。而構(gòu)建的模型A鏈和B鏈中164位的苯丙氨酸(PHE)和174位的谷氨酰胺(GLN)落在非允許區(qū)，但這兩個氨基酸并不位于HMGR與底物結(jié)合的保守序列中(圖3)。整體表明S.suisHMGR模型的立體構(gòu)象符合化學(xué)二面角分布的要求。SWISS MODEL構(gòu)建的模型G-factor參數(shù)為0.16，大于-0.5，說明模型中共價鍵及鍵角存在的構(gòu)象合理。質(zhì)量評價結(jié)果說明SWISS MODEL構(gòu)建的S.suisHMGR三維結(jié)構(gòu)模型合理可靠。

A. pH對酶活力的影響; B. 溫度對酶活力的影響A. Effect of pH on activity; B. Effect of temperature on activity圖2 pH和溫度對S. suis HMGR酶活力的影響Fig.2 Effect of pH, temperature on HMGR activity

破折號表示引入序列的空隙以優(yōu)化比對。數(shù)字表示氨基酸的位置。在所有的比對中，縮寫如下：S. pne, 肺炎鏈球菌；S. aga, 無乳鏈球菌；S. pyo, 釀膿鏈球菌；S. suis, 豬鏈球菌；S. epi, 表皮葡萄球菌；S. aur, 金黃色釀膿葡萄球菌；P. Mev, Pseudomonas Mevalonii；B. bur, 博氏螺旋體Dashes indicate gaps introduced into the sequence to optimize the alignment. Numbers refer to amino acid positions. In all alignments, abbreviations are as follows: S. pne, Streptococcus pneumoniae; S. aga, Streptococcus agalactiae; S. pyo, Streptococcus pyogenes; S. suis, Streptococcus suis; S. epi, Staphylococcus epidermidis; S. aur, Staphylococcus aureus; P. Mev, Pseudomonas Mevalonii; B. bur, Borrelia burgdorferi 圖3 球菌和螺旋體中HMGR多序列比對Fig.3 Multiple alignment of sequences of HMGR from coccus and Borrelia burgdorferi

圖4 S.suis HMGR同源建模二維顯示Fig.4 Two-dimensional display of homology modeling of S. suis HMGR

圖5 S. suis HMGR模型的拉馬錢德蘭圖Fig.5 Ramachandran plot of the 3D model of S. suis HMGR

3 討 論

S.suis給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展，也影響著人們的健康安全。人感染S.suis后出現(xiàn)的臨床癥狀包括腦膜炎、敗血病、關(guān)節(jié)炎等。有研究統(tǒng)計，目前為止，全球有30多個國家報道過人感染S.suis，有大約1 600例嚴(yán)重的人感染S.suis事例，并且在過去十年里，人感染S.suis事例急劇增加。為了對抗S.suis感染，研究人員用試驗證實(shí)至少有15個保護(hù)性抗原可以作為S.suis的候選疫苗。但是由于重組蛋白質(zhì)表達(dá)方式、菌株、免疫程序、免疫動物的差異，導(dǎo)致同一保護(hù)性抗原的免疫保護(hù)力結(jié)果不同[6, 26]。而且，S.suis日益增高的耐藥性使抗生素防控手段受限[8]。因此，需要尋找新的藥物靶標(biāo)，挖掘新型抗生素對抗S.suis感染。

合成IPP的甲羥戊酸途徑對部分革蘭陽性菌的存活非常重要[14]。HMGR是甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵限速酶，兩類HMGR都被作為藥靶研究報道過。有研究者以肺炎鏈球菌II類HMGR為藥靶，篩選出相應(yīng)的抑制劑[27]。本試驗中研究的S.suisHMGR也屬于II類HMGR，與肺炎鏈球菌HMGR氨基酸序列相似性為60%，可以以S.suisHMGR作為藥靶，進(jìn)一步挖掘防控S.suis感染的新型抗生素。本研究原核表達(dá)、純化了S.suisHMGR，并通過分光光度法測定了其最佳反應(yīng)條件和酶促動力學(xué)參數(shù)，為下一步篩選S.suisHMGR抑制劑提供方法和參考數(shù)據(jù)。由于S.suisHMGR三維結(jié)構(gòu)未知，本研究利用同源建模的方法，以已公布的肺炎鏈球菌HMGR晶體結(jié)構(gòu)為模板，構(gòu)建了S.suisHMGR可靠的三維結(jié)構(gòu)理論模型?；谄淅碚撊S結(jié)構(gòu)模型，下一步可以通過模擬分子對接，虛擬篩選針對S.suis感染的新型抗生素。本研究中S.suisHMGR酶活力的測定和理論模型的建立為篩選S.suisHMGR抑制劑，防控S.suis感染奠定了基礎(chǔ)。

甲羥戊酸途徑中5個酶——HMG-CoA合成酶、HMGR、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶，其編碼基因被阻斷后，限制了病原菌的增殖[14]。因此，除了HMGR外，其他4個酶也可以作為針對多耐藥性病原菌的新型抗生素靶標(biāo)，有進(jìn)一步研究的價值。例如，肺炎鏈球菌中HMG-CoA合成酶也被作為潛在的藥靶進(jìn)行初步研究過[28]。病原菌利用甲羥戊酸途徑或非甲羥戊酸途徑合成IPP，疾病防控中將甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸途徑中酶的抑制劑聯(lián)合使用，可以作用于多靶點(diǎn)，抑制不同的致病菌，擴(kuò)大抗菌譜，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

原核表達(dá)并純化S.suisHMGR后，測定該酶的活性，確定該酶在催化HMG-CoA還原為甲羥戊酸的反應(yīng)中的最佳反應(yīng)溫度和pH，以及Vmax和Km值。酶活力的測定為用試驗手段驗證S.suis抑制劑的有效性提供了可行性的方法。用同源建模的方法構(gòu)建S.suisHMGR三維結(jié)構(gòu)模型，構(gòu)建的S.suisHMGR模型將有助于虛擬篩選出對抗S.suis感染的新型抗生素。

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(編輯 白永平)

Prokaryotic Expression, Activity Assay and Homology Modeling of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase fromStreptococcussuis

LIU Can-ying1, XU Zhuo-fei2, FU Qiang1

(1.DepartmentofLifeSicenceandEngineering,FoshanUniversity,Foshan528000,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

The aim of this study was to take theStreptococcussuis(S.suis) 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) as a drug target, and provide theoretical and experimental basis for the development of novel antibiotics for the prevention and treatment ofS.suisinfection. In this experiment,S.suisHMGR was prokaryotically expressed and purified by Ni-NTA agrose. Its enzyme activity was determined by spectrophotometric method. In addition, a multiple sequence alignment of HMGR was performed by CLUSTALW to identify conserved domains. Homology modeling of the three-dimensional (3D) structure ofS.suisHMGR was performed by SWISS-MODEL. The quality of the model was evaluated by PROCHECK. The result of enzyme activity analyses showed that optimal reaction conditions ofS.suisHMGR was pH 5.0 and 37 ℃, theVmaxandKmvalue was 846 U·mg-1and 0.213 mmol·L-1respectively. The analysis of SWISS-MODEL showed that crystal structure ofStreptococcuspneumoniaHMGR was the appropriate template for homology modeling ofS.suisHMGR. The theoretic model of 3D structure ofS.suisHMGR was proven to be reliable through quality assessment. TheS.suisHMGR model will contribute to virtual screening of novel antibacterial agents againstS.suisinfection. Enzyme activity assay provides a feasible method for validation of effective inhibitors againstS.suisHMGR in biochemical experiment.

Streptococcussuis; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase; prokaryotic expression; protein expression; enzyme activity assay; homology modeling

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.021

2016-06-22

廣東普通高校青年創(chuàng)新人才項目(2015KQNCX173)；廣東省自然科學(xué)基金-博士啟動(2014A030310020)

劉璨穎(1986-)，女，湖北武漢人，助教，博士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail: liucy3032@163.com

S852.61

A

0366-6964(2016)11-2318-07