蔡小艷，李 勝，陳秋萍，王 萍，鄧 凱，劉慶友* ，石德順*

(1.廣西大學(xué)，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004； 2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001)

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水牛bbu-miR-103-1在泌乳期與非泌乳期表達模式及靶向基因的初步研究

蔡小艷1，2，李 勝1，陳秋萍1，王 萍1，鄧 凱1，劉慶友1*，石德順1*

(1.廣西大學(xué)，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004； 2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，南寧 530001)

旨在探討bbu-miR-103-1在水牛泌乳期和非泌乳期的差異表達模式，并預(yù)測其靶向調(diào)控基因及功能。本研究應(yīng)用qRT-PCR檢測bbu-miR-103-1，在水牛泌乳期和非泌乳期的差異表達。構(gòu)建bbu-miR-103-1前體表達質(zhì)粒LpEZX-pre-miR-103-1,并在293T細胞中包裝高滴度的慢病毒顆粒，用于感染水牛乳腺上皮細胞實現(xiàn)過表達bbu-miR-103-1，同時應(yīng)用化學(xué)合成的bbu-miR-103-1抑制劑轉(zhuǎn)染水牛上皮細胞實現(xiàn)抑制表達bbu-miR-103-1，研究bbu-miR-103-1對PANK3及乳脂代謝相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果表明，水牛泌乳期bbu-miR-103-1的相對表達量為非泌乳期的5.29倍(P<0.01)；成功構(gòu)建的慢病毒載體LpEZX-pre-miR-103-1包裝獲得了感染滴度為3.47×106PFU·mL-1的慢病毒顆粒；過表達和抑制表達bbu-miR-103-1分別極顯著下調(diào)和上調(diào)了水牛乳腺上皮細胞PANK3基因的相對表達量(P<0.01)；過表達bbu-miR-103-1極顯著提高了ACACA、GPAM、DGAT1和PDK4基因的表達(P<0.01)，對SREBP1c、ADFP、CD36、ACSS1等基因產(chǎn)生了顯著的上調(diào)作用(P<0.05)。過表達bbu-miR-103-1通過下調(diào)PANK3的表達，反饋提高了SREBP1c的mRNA水平，促進了以ACACA開頭的脂肪酸從頭合成。表明bbu-miR-103-1對水牛乳脂肪合成有十分重要的促進作用，為揭示水牛高乳脂形成和調(diào)控機理提供了分子依據(jù)。

水牛；bbu-miR-103-1；表達模式；PANK3

小的非編碼RNA分子miRNA，大小為18～25 nt個核苷酸，由生物體自身的基因轉(zhuǎn)錄而成，在轉(zhuǎn)錄后和轉(zhuǎn)錄前水平上參與基因表達的調(diào)控[1-3]。據(jù)估算，miRNA可能對所有哺乳動物的2%～5%的基因負責(zé)，調(diào)節(jié)多達60%的蛋白編碼基因[4]。miRNA通過與靶mRNA的堿基互補配對，使靶mRNA降解或者沉默從而起到調(diào)控基因表達的作用。miRNA在細胞增殖、分化和凋亡等發(fā)育和特殊生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。在乳腺細胞中已經(jīng)鑒定出miRNA[6-7]，乳腺細胞有自己專有的miRNAs，在小鼠和人類乳腺組織都發(fā)現(xiàn)特別的miRNAome表達型，人類乳腺特異信號以23miR為主要特征，而小鼠的特異信號是以miR-let-7a等9個miR為主要特征[8]。大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的miRNA在哺乳期的表達模式中發(fā)生變化，對泌乳性能產(chǎn)生影響[9]。56個miRNAs在泌乳期和干乳期存在差異表達, 相比泌乳高峰期，干乳期只有34%的miRNA表達，相對于干乳期而言有165個miRNAs在泌乳高峰期下調(diào)表達[10]，這些在干乳期和泌乳高峰期發(fā)生變化的miRNA對泌乳的乳脂、乳蛋白等通路起到重要的作用。bta-miR-103是一個目前研究較多的乳腺miRNA, 它包括bta-miR-103-1 和bta-miR-103-2，具有相同的成熟序列，由不同染色體加工而來，miR-103-1由20號染色體的189857-189928 [-]sense ENSBTAT00000015780位點PANK3-201(Pantothenate Kinase 3)第5個內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來，據(jù)報道m(xù)iR-103-1通過作用靶基因PANK3主要對小鼠和奶山羊的乳脂代謝起重要作用[11-12]，本試驗室Solexa高通量測序結(jié)果表明，bbu-miR-103-1存在于水牛乳腺細胞，而且在泌乳和非泌乳期差異表達，因此選擇miR-103-1進行了深入研究。奶樣自動分析儀分析乳汁成分顯示，水牛乳脂率((6.70±0.72)%)含量為荷斯坦奶牛((3.02±0.17)%)的2.22倍，極顯著高于荷斯坦奶牛的乳脂率。

為了探索水牛miR-103-1在泌乳期和非泌乳期表達模式、靶基因及對水牛高乳脂是否有作用，本研究通過構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒感染水牛乳腺上皮細胞實現(xiàn)過表達bbu-miR-103-1，化學(xué)合成抑制劑抑制bbu-miR-103-1表達，對miR-103-1的功能進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 所用細胞 試驗所用泌乳期和非泌乳期乳腺組織取自南寧屠宰場。感受態(tài)細胞、293T細胞為本實驗室保存，水牛乳腺上皮細胞為本試驗培養(yǎng)。

1.1.2 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、低溫離心機(Beckman)、熒光定量PCR儀(Life Technology)、超凈工作臺(蘇州凈化)、體視顯微鏡(尼康)、熒光顯微鏡(奧林巴斯)、倒置顯微鏡(尼康)、ChemiDoc 凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、激光共聚焦顯微鏡(尼康)。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、FBS、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑等均購自Life Technology 公司，熒光定量SYBR Green Master、 Mix羅氏轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司，一步快速反轉(zhuǎn)試劑盒購自TaKaRa寶生物公司，引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因引物設(shè)計 根據(jù)miR-103-1序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中已有基因序列，利用OLigo 6.0 引物設(shè)計軟件進行設(shè)計，由上海生工進行合成，bbu-miR-103-1的反轉(zhuǎn)錄引物L(fēng)oop-RT-miR-103-1為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATAG-3′，bbu-miR-103-1的定量引物為5′-GGAGCAGCATTGTACAGGGC-3′，內(nèi)參基因為U6的反轉(zhuǎn)錄引物為：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT，U6的定量引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。

表1 基因的Q-PCR引物

Table 1 Gene Q-PCR primers

基因名稱Genename上游引物(5'-3')Forwardprimer下游引物(5'-3')Reverseprimerβ-actinGCCCTGGCACCCAGCACAATGGAGGGGCCGGACTCATCGTPANK3ACATTGGTTCGGGAGTCAGTTCACAGCCAGTCAACAAGC

1.2.2 乳腺組織采集、RNA提取及QRT-PCR 凌晨02:00～04:00去屠宰場隨機選取剛屠宰的不同水牛的乳腺組織，仔細觀察不用擠壓就有白色乳汁不斷滲出的乳腺組織為泌乳期樣本，用力擠壓也無白色乳汁滲出的乳腺組織為非泌乳期樣本，泌乳期和非泌乳期乳腺組織各取3個個體樣本重復(fù)，生理鹽水沖洗后，迅速用眼科手術(shù)剪從組織深處剪取1～2 g，放于2 mL EP管，馬上放入液氮罐帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存，然后用剪刀取冷凍的水牛乳腺組織大約100 mg，用Trizol法提取總RNA，利用TaKaRa 的AMV試劑盒特異性反轉(zhuǎn)cDNA。

1.2.2.1 cDNA第一鏈的合成和PCR(RT-PCR)[13]：10 μL體系：2 μg乳腺總RNA，1 μL RRT，1 μL DNase I，1 μL 10×Buffer，RNA free H2O補足至10 μL。將上述混合物混勻并瞬時離心后，放入預(yù)熱好的PCR儀，37 ℃作用40 min，之后加入EDTA 1 μL，放入PCR儀，65 ℃作用10 min，終止DNase I消化；分別加入以下試劑：1 μL miRNA特異性引物(10 mmol·L-1)，1 μL內(nèi)參U6特異性引物(10 mmol·L-1)，4 μL AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，2 μL AMV 5× Buffer，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)。將上述混合物輕輕混勻之后放入已經(jīng)預(yù)熱好的PCR儀，按照以下程序進行反轉(zhuǎn)錄：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃終止反應(yīng)。最后用ddH2O稀釋至80～100 ng·μL-1，用于RT-PCR或者定量試驗。

1.2.2.2 熒光定量PCR：將制備得到的cDNA用無RNase水稀釋終濃度為100 ng· mL-1，反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA，10 μL熒光定量試劑，0.6 μL上下游引物(10 μmol·L-1)，8.4 μL無RNA酶水。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃或者55 ℃ 1 min，此步驟進行熒光收集，40個循環(huán)。每個樣品進行3次重復(fù)，運用2-△△Ct的方法計算目的基因的相對表達量。U6作為miR-103-1內(nèi)參，β-actin作為基因?qū)φ?，檢測分析PANK3等基因的表達情況。

1.2.3 水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng) 選取屠宰的新鮮的泌乳期水牛乳腺組織塊，浸泡在生理鹽水中帶回實驗室，用生理鹽水沖洗3次，隨后用眼科剪在組織深處選取乳腺組織的腺泡部分，用75%酒精噴灑消毒，轉(zhuǎn)移入高抗PBS液中，再放進超凈工作臺的培養(yǎng)皿中，然后用高抗PBS和低抗PBS分別清洗至液體基本澄清，再用75%酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)移至2×PBS中重復(fù)清洗2遍，轉(zhuǎn)移到15 mL管中，剪碎到1～2 mm的小塊，最后用培養(yǎng)液潤洗，用小鑷子和槍頭將組織塊平鋪在培養(yǎng)皿的底部，隨后倒置于37 ℃的飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，再將培養(yǎng)皿正置并補加1 mL的細胞培養(yǎng)液沒過組織塊，過夜后再補加2 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)， 2～3 d換液1次。7 d左右成纖維細胞從組織塊游離生長出來，12 d左右乳腺上皮細胞逐漸長出，然后運用胰蛋白酶差異消化法結(jié)合細胞貼壁速度的不同分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞，將混合生長至匯合的細胞用PBS洗3遍，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化3 min，隨后用含血清的培養(yǎng)液終止消化，輕輕將變圓或漂起的細胞洗下，隨后用胰蛋白酶繼續(xù)消化，將消化得到的細胞培養(yǎng)2～3 h后，收集細胞培養(yǎng)液，將沒有貼壁的乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次純化后，得到較為純凈的乳腺上皮細胞作為轉(zhuǎn)染細胞使用[14]。

1.2.4 慢病毒載體骨架及質(zhì)粒構(gòu)建 miRNAs由Pre-miRNA剪切加工而來，pre-miRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可以保證miRNA的穩(wěn)定性。因此構(gòu)建包含目的miRNA-103-1前體miExpressTMPrecursor 的miRNA慢病毒表達質(zhì)粒LpEZX-pre-miR-103-1和空質(zhì)粒LpEZX-miR-NC，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌體內(nèi)，從而使得miRNA-103-1隨細菌的增加而擴增。連接轉(zhuǎn)化等操作步驟見參考文獻(圖1)[12]。

圖1 慢病毒載體骨架的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of lentivirus vector

1.2.5 慢病毒質(zhì)粒 LpEZX-pre-miR-103-1在293T細胞中的包裝和擴繁 復(fù)蘇的293T細胞傳代后，用Poly賴氨酸鋪皿用于轉(zhuǎn)染試驗，然后運用羅氏法包裝和擴繁慢病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h開始觀察細胞的綠色熒光蛋白表達情況，72 h后待大多數(shù)細胞呈圓形、且出現(xiàn)明顯的葡萄串狀結(jié)構(gòu)時收集病毒并測定病毒滴度。

1.2.6 病毒顆粒感染乳腺上皮細胞 于60 mm培養(yǎng)皿中加入病毒液1 mL，以正常水牛乳腺上皮細胞為對照，48 h后觀察綠色熒光蛋白表達情況，72 h后收集細胞，用于RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，并進行定量分析。

1.2.7 miR-103-1抑制劑及轉(zhuǎn)染 化學(xué)合成miR-103-1抑制劑，序列：5′-TCGTCGTUUCUTGTCCCGUTUCT-3′,用于乳腺細胞的轉(zhuǎn)染試驗，參照Lipo-2000試劑說明進行轉(zhuǎn)染。

1.2.8 統(tǒng)計分析 所有QRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果重復(fù)3次，利用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，分析差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 水牛bbu-miR-103-1在泌乳期和非泌乳期乳腺組織中的表達模式

本實驗室Solexa高通量測序結(jié)果表明，bbu-miR-103-1在泌乳期總序列標簽為8456705，在非泌乳期總序列標簽為7665749，重疊轉(zhuǎn)錄區(qū)(Overlapping transcripts)都在內(nèi)含子，其中bbu-miR-103-1在chr20_2864127_2864198_+上，編碼基因是ENSbtaG00000011895，前體序列為5′-CTGC-CCTCGGCTTCTTTACAGTGCTGCCTTGTTGCATA-TGGATCAAGCAGCATTGTACAGGGCTATGAAGGC-3′，結(jié)合自由能為-119.72 kJ·mol-1；bbu-miR-103-2，在chr13_51838778_51838853_-上，編碼基因是ENSbtaG00000007920，前體序列為5′-TTGTGC-TTTCAGCTTCTTTACAGTGCTGCCTTGTAG-CATTCAGGTCAAGCAGCATTGTACAGGGCT-ATGAAAGAAC-3′，莖環(huán)自由能為-115.12 kJ·mol-1, 其成熟序列都為：5′-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA-3′，bbu-miR-103表達有極顯著差異。

因此分析了水牛bbu-miR-103-1序列，設(shè)計了特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物L(fēng)oop-RT-miR-103-1和定量引物，在乳腺組織上反復(fù)和重復(fù)篩選到反轉(zhuǎn)特異性較好的Loop-RT-miR-103-1引物和單峰且熔解溫度在80℃左右的熔解曲線QRT-PCR引物，用驗證過的引物進行后續(xù)QRT-PCR。結(jié)果顯示，水牛bbu-miR-103-1的相對表達量在泌乳期為非泌乳期的5.29倍，差異極顯著(P<0.01, 圖2)，說明bbu-miR-103-1在乳腺組織中表達模式是動態(tài)變化的，推測bbu-miR-103-1表達的改變可能對泌乳發(fā)揮重要調(diào)控作用。

圖中所標字母相異表示差異顯著(P<0.05或P<0.01)，所標字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；大寫和小寫字母分別表示0.01和0.05水平。圖8同Different letters means significant difference between the groups(P<0.05 or P<0.01)，and same letters means no significant difference between the groups(P>0.05)；Capital letters and lowercase letters means 0.01 and 0.05 levels, respectively. The same as Figure 8圖2 bbu-miR-103-1在泌乳期和非泌乳期的相對表達量Fig.2 The relative expression of bbu-miR-103-1 in lactation and non-lactation periods

2.2 慢病毒表達載體的成功構(gòu)建與包裝

2.2.1 慢病毒載體的構(gòu)建 基于人免疫缺陷慢病毒系統(tǒng)的載體骨架，構(gòu)建了攜帶 bbu-miR-103-1前體序列5′-CTGCCCTCGGCTTCTTTACAGTGCTGCCTTGTTGCATATGGATCAAGCAGCA-TTGTACAGGGCTATGAAGGC-3′的前體表達克隆質(zhì)粒 LpEZX-pre-miR-103-1，大小為8 219 bp，圖3為質(zhì)粒提取后電泳鑒定結(jié)果，略大于8 023 bp，說明構(gòu)建的質(zhì)粒是正確的。

2.2.2 bbu-miR-103-1慢病毒質(zhì)粒的包裝和擴繁 LpEZX-pre-miR-103-1 與空質(zhì)粒 LpEZX-miR-NC分別與NRF(Packaging plasmid)和VSV-G(Envelop plasmid encoding the vesicular stomatitis virus-G glycoprotein)在293T細胞中進行包裝，12 h后換液，48 h觀察綠色熒光蛋白發(fā)光情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和miR-103-1組都有綠色熒光表達，說明病毒包裝成功。與正常細胞的形態(tài)相比，感染后細胞形態(tài)變圓、變大，并伴有典型的葡萄串狀病變結(jié)構(gòu)(圖4)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1.LpEZX-pre-miR-NC 載體；2. LpEZX-pre-miR-103-1載體M. DNA marker; 1.LpEZX-pre-miR-NC vector; 2. LpEZX-pre-miR-103-1 vector圖3 LpEZX-pre-miR-103-1慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建Fig.3 Construction of lentivirus vector LpEZX-pre-miR-103-1

A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2分別為空質(zhì)粒和pre-miR-103-1侵染293T細胞48 h后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果；A1、B1、C1、D1為常光下觀察結(jié)果；A2、B2、C2、D2分別為A1、B1、C1、D1 對應(yīng)的綠色熒光下觀察結(jié)果A1,A2,B1,B2 and C1,C2,D1,D2 are the results of observation of 293T cells infected separately by empty plasmid-LpEZX-miR-NC and LpEZX-pre-miR-103-1 after 48 h; A1,B1,C1,D1 are the results of observation in nature light;A2,B2,C2, D2 are the results of observation in green fluorescence corresponding to A1,B1,C1,D1圖4 慢病毒質(zhì)粒侵染293T細胞48 h后觀察包裝結(jié)果Fig.4 Packaged results of 293T cells infected by lentivirus vector after 48 h

2.2.3 慢病毒質(zhì)粒 bbu-miR-103-1滴度測定結(jié)果 在293T 細胞系中感染慢病毒質(zhì)粒病毒上清液，在隨機選取的10個視野里測定病毒的滴度，結(jié)果表明，空載滴度達3.42×106PFU·mL-1，bbu-miR-103-1病毒滴度為3.47×106PFU·mL-1(圖5)。結(jié)果表明，bbu-miR-103-1與對照的滴度相當(dāng)，可以進行等量病毒感染。

2.3 慢病毒介導(dǎo)miR-103-1中的過表達結(jié)果

2.3.1 乳腺上皮細胞的培養(yǎng) 采用組織塊法培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞，乳腺上皮細胞12 d左右逐漸生長出來，細胞間排列緊密，呈多角形，單層緊密向外生長，長至15 d左右如鵝卵石鋪路(圖6)，呈典型的動物乳腺上皮細胞特征。

A1、A2、B1、B2和C1、C2、D1、D2分別為隨機選取的空質(zhì)粒和pre-miR-103-1質(zhì)粒病毒滴度感染293T細胞的測定視野；A1、B1、C1、D1為常光下觀察結(jié)果；A2、B2、C2、和D2分為A1、B1、C1、D1 對應(yīng)的綠色熒光下觀察結(jié)果A1,A2,B1,B2 and C1,C2,D1,D2 are detection fields of view selected randomly of 293T cells infected by empty plasmid-LpEZX-miR-NC and LpEZX-pre-miR-103-1, separately; A1,B1,C1,D1 are the results of observation in nature light;A2,B2,C2，D2 are the results of observation in green fluorescence corresponding to A1,B1,C1,D1圖5 病毒上清液滴度測定Fig.5 Titer detection of supernatant of lentivirus

A和B為原代水牛乳腺上皮細胞從組織中生長出來；C和D為水牛乳腺上皮細胞A and B are the primary buffalo mammary epithelial cells from mammary tissue；C and D are buffalo mammary epithelial cells圖6 用于感染的水牛乳腺上皮細胞Fig.6 Buffalo mammary gland epithelial cells used for infected

2.3.2 乳腺上皮細胞的感染 用1 mL對照和miR-103-1病毒原液分別感染水牛乳腺上皮細胞，體外培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下可見綠色熒光(圖7)。且綠色熒光發(fā)光較亮，表明miR-103-1及空載對照病毒顆粒已經(jīng)成功地進入了水牛乳腺上皮細胞中，并且質(zhì)粒代謝產(chǎn)生了過量的空載和miR-103-1，質(zhì)粒進入了工作狀態(tài)，這時eGFP在乳腺上皮細胞中發(fā)出綠色熒光。

2.4 過表達和抑制表達bbu-miR-103-1對水牛乳脂合成相關(guān)基因的影響

2.4.1 過表達和抑制表達bbu-miR-103-1對推測靶基因PANK3的影響 生物信息學(xué)預(yù)測bbu-miR-103-1的可能靶基因為1 160個，其中包括PANK3，得分146分，根據(jù)其他物種miR-103-1對PANK3及乳脂代謝通路影響，選擇PANK3及乳脂通路的相關(guān)基因進行QRT-PCR檢測。利用化學(xué)合成的miR-103-1抑制劑轉(zhuǎn)染水牛乳腺上皮細胞實現(xiàn)抑制表達，運用慢病毒過表達載體LpEZX-pre-miR-103-1感染水牛乳腺上皮細胞實現(xiàn)過表達miR-103-1，然后QRT-PCR檢測了過表達和抑制表達bbu-miR-103-1對可能預(yù)測的靶向基因PANK3的作用。

A1、A2和B1、B2、C1、C2分別為空質(zhì)粒和LpEZX-pre-miR-103-1侵染水牛乳腺上皮細胞48 h后的熒光顯微鏡觀察結(jié)果；A1、B1、C1為常光下觀察結(jié)果；A2、B2、C2為綠色熒光下觀察結(jié)果A1,A2 and B1,B2,C1,C2 are the results of observation of buffalo mammary gland epithelial cells infected separately by empty plasmid(LpEZX-miR-NC) and LpEZX-pre-miR-103-1 after 48 h； A1,B1,C1 are the results of observation in nature light；A2,B2,C2 are the results of observation in green fluorescence圖7 空質(zhì)粒和LpEZX-pre-miR-103-1過表達慢病毒質(zhì)粒感染乳腺上皮細胞的結(jié)果Fig.7 Observation of buffalo mammary gland epithelial cells infected by empty plasmid (LpEZX-miR-NC) and LpEZX-pre-miR-103-1

QRT-PCR結(jié)果表明，過表達miR-103-1能夠極顯著降低水牛乳腺細胞PANK3的表達(P<0.01)，而miR-103-1抑制劑極顯著提高水牛乳腺細胞PANK3基因的表達(P<0.01)，說明水牛bbu-miR-103-1與PANK3表達量有負向調(diào)控規(guī)律，根據(jù)慢病毒質(zhì)粒過表達miR-103-1工作原理，結(jié)合檢測過表達和抑制劑對其他基因沒有顯著的負向調(diào)控規(guī)律，預(yù)測PANK3為miR-103-1的作用靶基因。

2.4.2 水牛miR-103-1對乳脂合成代謝通路的作用 水牛乳脂合成乳成分中需要多個基因的協(xié)調(diào)作用來進行有效的轉(zhuǎn)錄、翻譯和分析，涉及多個生化途徑，包括脂肪酸從頭合成、甘油三脂合成、乳脂滴合成和分泌、脂肪酸吸收、 脂肪酸激活、脂解及釋放、脂肪酸氧化和脂肪酸受體等多個過程，涉及到復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了探明miR-103-1過表達對水牛乳脂合成代謝通路的級聯(lián)反應(yīng)，檢測了8個乳脂代謝步驟中22個相關(guān)基因表達量的變化。結(jié)果表明,過表達miR-103-1對FASN作用不顯著(P>0.05)；而過表達miR-103-1極顯著上調(diào)了ACACA的表達(P<0.01)，說明miR-103-1主要以促進ACACA開頭的脂肪酸合成為主。轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1c)和核受體(LXRa)等是調(diào)控乳脂合成相關(guān)基因表達的重要因子。過表達miR-103-1能夠顯著提高SREBP1c的表達(P<0.05)，但是對LXRa基因的表達水平作用不顯著(P>0.05)，表明miR-103-1能夠通過影響靶基因PANK3促進SREBP1c信號通路的乳脂合成。過表達miR-103-1主要對脂肪酸從頭合成、甘油三脂合成、乳脂滴合成和分泌、脂肪酸吸收和脂肪酸激活等5個乳脂代謝基因起作用，主要對ACACA、GPAM、DGAT1和PDK4產(chǎn)生極顯著的上調(diào)作用(P<0.01)，對SREBP1c、ADFP、CD36、ACSS1等基因產(chǎn)生顯著的上調(diào)作用(P<0.05)。

圖8 過表達和抑制表達miR-103-1對靶基因PANK3表達的影響Fig.8 Effect of overexpress and suppression of miR-103-1 on the expression of target gene PANK3

表2 過表達miR-103-1對脂肪酸通路其他相關(guān)基因表達的影響

Table 2 Effect of overexpress of miR-103-1 on the expression of other related genes in milk fat metabolism

基因Genesymbol基因介紹GenedescriptionmiR過表達的上皮細胞miR-103-1infectedcells脂肪酸從頭合成DenovofattyacidsynthesisFASN脂肪酸合成酶0.44±0.28ACACA乙酰輔酶A羧化酶α3.06±0.43**ACSS2短鏈?；o酶合成酶21.00±0.09SREBP1c轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白11.86±0.35*LXRa核受體1.25±0.28甘油三脂合成TriglyceridesynthesisSCD短脂酰輔酶1.12±0.22GPAM甘油三酯磷酸化?；D(zhuǎn)移酶3.76±0.48**AGPAT6磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶1.05±0.45DGAT1二?；视王；D(zhuǎn)移酶2.33±0.02**LEPIN1脂素基因11.58±1.73乳脂滴合成和分泌MilkfatdropletformationandsecretionADFP脂肪分化相關(guān)蛋白1.61±0.36*TIP4747kD的尾連蛋白1.02±0.26gBTNIA1嗜乳脂蛋白基因1.14±0.78脂肪酸吸收FattyaciduptakeCD36跨膜蛋白CD361.96±0.36*脂肪酸激活FattyacidactivationACLYATP檸檬酸裂解酶基因1.00±0.10ACSS1短鏈酰基輔酶合成酶21.20±0.43*PDK4丙酮酸脫氫酶激酶4.74±0.45**脂解及釋放LipolysisandreleaseCPT1肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-11.00±0.06ATGL脂肪甘油三酯脂肪酶1.01±0.20脂肪酸氧化FattyacidoxidationAMPKα單磷酸腺苷活化蛋白激酶1.00±0.13脂肪酸受體FattyacidreceptorGPK41G蛋白偶聯(lián)受體41———DGAT甘油?；D(zhuǎn)移酶1.00±0.06

*.P<0.05;**.P<0.01

3 討 論

許多miRNA靶向乳腺細胞基因參與調(diào)控乳腺的泌乳。比如T.Tanaka等利用芯片、基因敲除和載體構(gòu)建技術(shù)揭示了miR-101a可以調(diào)節(jié)β酪蛋白表達，miR-101a 和miR-199a通過調(diào)節(jié)Cox-2參與到乳腺上皮細胞的生長發(fā)育中[15]；miR-126在乳腺上皮細胞中靶向于孕激素受體[16]； 馮麗等利用生物信息學(xué)分析證明let-7g靶向于Tgfbr1來調(diào)節(jié)鼠乳腺上皮細胞的生長和泌乳[17], miR-139靶向于GHR基因來調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞的泌乳[18]。在脂類代謝過程中，miRNA是一類重要的調(diào)控因子，miR-33能夠沉默CPT1A(Carnitine palmitoyl transferase1A)基因，降低脂肪酸β氧化, miR-122調(diào)節(jié)脂類代謝相關(guān)基因的表達[19]。已有研究表明，miRNA-103家族的miR-103-1位于PANK3的第5內(nèi)含子，在泌乳中期高表達，通過靶向調(diào)控宿主基因PANK3，從而調(diào)控薩能山羊的乳脂代謝，過表達miR-103能夠增加乳腺上皮細胞脂滴含量，甘油三酸酯和脂肪酸含量，上調(diào)PPARc、DGAT1、ABCA1、LXRa、ABCG1、SREBP1c、FASN和ACACA基因的表達，而FASN和ACACA是SREBP1c的下游靶基因[20]。

本研究在水牛乳腺組織中測序發(fā)現(xiàn)了bbu-miR-103-1，并對其靶基因進行了定位等相關(guān)生物信息學(xué)分析。對miR-103在水牛乳腺上皮細胞中靶基因的研究發(fā)現(xiàn)，水牛miR-103-1與PANK3的表達量成反比，說明miR-103-1通過調(diào)控靶基因PANK3(Pantothenate kinase 3)來發(fā)揮作用。PANK3編碼一個屬于泛酸激酶家族的蛋白，泛酸激酶是一個在細菌和哺乳動物輔酶A的生物合成中起著關(guān)鍵作用的調(diào)控酶，它催化通向普通生物合成輔酶A(CoA)的第一個關(guān)鍵步驟。PANK3作為細胞內(nèi)CoA的抑制調(diào)控劑[21]，而乙酰CoA是乙酸在胞質(zhì)中生成，乙酸是乳腺脂肪酸最開始合成的4碳單位的兩個提供者之一(另一個是beta-羥丁酸)，即乙酰CoA在脂肪酸合成時為碳鏈的延長提供碳原子，為合成的原材料。miR-103-1過表達降低了靶基因PANK3的表達，從而解除了PANK3對乙酰CoA的抑制調(diào)控作用，促進了乙酰CoA為脂肪酸合成提供更多的原材料，從而促進脂肪酸的從頭合成。而從頭合成脂肪酸在細胞內(nèi)有FASN和ACACA酶兩條主要途徑。SREBP1c和LXRa是調(diào)控脂類合成的主要調(diào)節(jié)元件[22], 他們通過結(jié)合下游基因的核酸序列來啟動基因的表達，并相互調(diào)節(jié)平衡以維持細胞狀態(tài)的平衡[10]。本研究表明，過表達miR-103-1在水牛乳腺細胞中確實促進了ACACA開頭的乳脂合成，并且可能是通過顯著提高SREBP1c轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達水平來實現(xiàn)的，因為其對LXRa沒有呈現(xiàn)出類似的顯著相關(guān)性關(guān)系。其中，miR-103-1對PANK3的靶向調(diào)控作用，過表達提高SREBP1c和ACACA基因的表達結(jié)果與之前研究類似，但是本研究檢測對LXRa表達結(jié)果與之前研究有所不同[23]，這可能因為物種不同導(dǎo)致，具體機理尚需進一步研究。過表達miR-103-1還對GPAM、DGAT1、ADFP、CD36和PDK4等基因產(chǎn)生了顯著的上調(diào)作用。水牛的乳脂含量約是奶牛的2倍，是否與此直接相關(guān)，是否可以應(yīng)用在提高奶牛的乳脂含量方面，還有待進一步在奶牛活體進行研究。

bbu-miR-103-1的研究也可為其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。miRNAs在醫(yī)學(xué)中有多重作用,自從1965年之后就知道嬰兒對乳球蛋白的不容納性[24]導(dǎo)致一些嬰兒對奶的過敏問題[25]。C. Merkl等報道了人工miRNA在豬上具有阻止乳球蛋白表達的作用[26]。A. Jabed等通過表達miRNA-6和miRNA-4成功獲得了生產(chǎn)不含乳球蛋白的轉(zhuǎn)基因牛[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，bbu-miR-103-1在水牛乳脂代謝通路中有作用，在人類和小鼠中miR-103-1中也有類似作用，比如在3T3-L1和脂肪細胞中高富集[28-29]。miR-103-1在肥胖的小鼠中表達上調(diào)，miR-103-1是胰島素受體的關(guān)鍵調(diào)控者微囊蛋白Caveolin-1的直接靶基因。miR-103-1失活能夠上調(diào)脂肪細胞Caveolin-1表達且伴隨胰島素受體的穩(wěn)定性，促進胰島素信號通路，降低脂肪細胞大小[30]。本研究結(jié)果可為醫(yī)學(xué)上揭示bbu-miR-103作用機理提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

水牛bbu-miR-103-1在泌乳期表達量為非泌乳期的5.29倍，差異顯著(P<0.05)；本研究成功構(gòu)建、包裝和擴繁生產(chǎn)了滴度較高的水牛bbu-miR-103-1的慢病毒質(zhì)粒LpEZX-pre-miR-103-1的病毒顆粒；過表達和抑制表達bbu-miR-103-1與乳腺細胞靶基因PANK3的表達量呈負相關(guān)；過表達bbu-miR-103-1，通過下調(diào)PANK3的表達，反饋提高SREBP1c的mRNA水平，促進了SREBP1c信號通路的乳脂合成，最終促進了以ACACA開頭的的脂肪酸的從頭合成。bbu-miR-103-1對水牛脂肪合成具有十分重要的調(diào)控作用。

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(編輯 郭云雁)

Expression Pattern and Target Regulation Gene of bbu-miR-103-1 from Lactation and Non-lactation Periods inB.bubalis

CAI Xiao-yan1,2， LI Sheng1，CHEN Qiu-ping1，WANG Ping1， DENG Kai1，LIU Qing-you1*，SHI De-shun1*

(1.StateKeyLaboratoryofTropicalBiologicalResourcesProtectionandUtilization,GuangxiUniversity，Nanning530004，China；2.GuangxiInstituteofAnimalScience，Nanning530001，China)

This study aimed to investigate the expression pattern of bbu-miR-103-1 from lactation and non-lactation periods in buffalo (Bubalusbubalis), and to predict its target gene and function. Expression pattern of bbu-miR-103-1 in lactation and non-lactation periods were detected by qRT-PCR. The precursor expression plasmid of bbu-miR-103-1 was constructed and named LpEZX-pre-miR-103-1 (HIV). It was packaged and propagated to produce high-titer lentivirus in 293T cell lines，which could be used to infect buffalo mammary epithelial cells (BMECs) and over express bbu-miR-103-1. The inhibitor of bbu-miR-103-1 was chemically synthesized and transfected into BMECs to suppress bbu-miR-103-1 at the same time. The relative expression of pantothenate kinase 3(PANK3) and milk fat metabolism related genes were detected by qRT-PCR. The results showed that the relative expression of bbu-miR-103-1 from lactation period was 5.29 times higher than that from non-lactation period in buffalo(P<0.01). The LpEZX-pre-miR-103-1 has been successfully constructed and packaged with the infection titer for 3.47×106PFU·mL-1. Overexpress or suppress of bbu-miR-103-1 extremely significantly down-regulated or up-regulated(P<0.01) the expression level ofPANK3 in BMECs. Over expression of bbu-miR-103-1 extremely significantly enhanced the expression of Acetyl-CoA carboxylase alpha (ACACA), Glycerol-3-phosphate acyltransferase 1 mitochondrial (GPAM), Diacylglycerol O-acyltransferase 1(DGAT1) and Pyruvate dehydrogenase lipoamide kinase isozyme 4(PDK4) (P<0.01)，and also siginificantly up-regulated the expression of sterol regulatory element binding protein-1c(SREBP1c), Adipose differentiation-related protein(ADFP), Cluster of differentiation 36(CD36), Acetyl-CoA synthetase short-chain subfamily member 1(ACSS1)(P<0.05). Over expression of bbu-miR-103-1 down-regulated the expression ofPANK3，and improved the mRNA level ofSREBP1cby feedback regulation，finally promoted the de novo synthesis of fatty acid fromACACApathway. bbu-miR-103-1 plays an important role in enhancing milk fatty acid synthesis, which provides a molecular base for revealing the mechanism of high-level milk fat content in buffalo.

buffalo；bbu-miR-103-1；expression pattern；PANK3

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.006

2016-01-11

國家自然科學(xué)基金(31260552)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2011AA100607)；優(yōu)勢生態(tài)牧草品種遴選及果草耦合系統(tǒng)碳氮源匯的研究與示范(桂科合14125008-2-13)；國審牧草新品種紫色象草的繁育與推廣(桂漁牧科201453057)

蔡小艷(1982-)，女，山西興縣人，博士生，主要從事動物生殖生理及牧草研發(fā)，E-mail: caixiaoyan282@163.com

*通信作者：石德順，博士，研究員，主要從事動物生殖生理研究，E-mail: ardsshi@gxu.edu.cn；劉慶友，博士，研究員，主要從事動物生殖生理研究，E-mail: qyliu2002@126.com

S823.83;S813.3

A

0366-6964(2016)11-2191-11