林師 張麗莉 王國(guó)棟

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門361021）

雜色鮑兩種perlucin基因的克隆與表達(dá)分析

林師 張麗莉 王國(guó)棟

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門361021）

利用SMART RACE技術(shù)克隆雜色鮑兩個(gè)甘露聚糖結(jié)合型凝集素（mannan-binding lectin，MBL）成員perlucin1和perlucin4基因的全長(zhǎng)cDNA序列，使用Real time PCR分析這些基因在雜色鮑不同組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，雜色鮑perlucin1 cDNA序列全長(zhǎng)為668 bp，165個(gè)氨基酸，經(jīng)分析該基因含有2個(gè)二硫鍵、2個(gè)糖基化位點(diǎn)和13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)蛋白分子量約為18.8 kD，等電點(diǎn)約為4.57；perlucin4 cDNA序列全長(zhǎng)為587 bp，156個(gè)氨基酸，含有2個(gè)二硫鍵、1個(gè)糖基化位點(diǎn)和7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)蛋白分子量約為17.8 kD，等電點(diǎn)約為4.43；鰓、肝胰腺、血淋巴、上足、外套膜、黏液腺、腎臟7個(gè)組織中，perlucin1基因和perlucin4基因只有在肝胰腺中表達(dá)，在其它組織中沒有檢測(cè)到表達(dá)。結(jié)果表明，perlucin基因參與了雜色鮑天然免疫防御機(jī)制，在免疫識(shí)別中發(fā)揮著重要作用。

perlucin凝集素；甘露聚糖結(jié)合型凝集素；實(shí)時(shí)定量PCR

現(xiàn)在普遍認(rèn)為無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫防御體系更多的依賴于天然免疫反應(yīng)，該反應(yīng)包括依靠吞噬作用的細(xì)胞免疫和以非特異性免疫因子的綜合作用而完成的體液免疫。由于缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，它們主

要依靠天然免疫系統(tǒng)抵御各種病原的入侵，維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)［1］。當(dāng)無(wú)脊椎動(dòng)物遭受病原感染后，天然免疫系統(tǒng)首先通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition molecule，PRM）識(shí)別辨別非己物質(zhì)，而后引發(fā)免疫信號(hào)的調(diào)整和放大，激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并導(dǎo)致各種免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，繼而針對(duì)不同病原產(chǎn)生各種有效的免疫效應(yīng)，最終將病原體殺死和清除［2］，因此包括凝集素在內(nèi)的模式識(shí)別分子在軟體動(dòng)物的免疫識(shí)別中起著極其重要的作用。凝集素能選擇性識(shí)別多糖結(jié)構(gòu)并與之特異性非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)。甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）廣泛存在動(dòng)物體內(nèi)并由肝細(xì)胞合成和分泌，是Ca2+依賴型C型凝集素超家族中膠原凝素之一。因?yàn)樵撃乜勺R(shí)別并結(jié)合具有甘露聚糖末端的糖蛋白，故又稱甘露聚糖結(jié)合蛋白（mannan-binding protein，MBP）［3］。MBL是先天性免疫系統(tǒng)中的重要成員，由多條肽鏈組成的寡聚物。每條肽鏈包含4個(gè)區(qū)域：富含半胱氨酸的N末端（cysteine-rich regions）、膠原樣區(qū)（collagen-like region）、頸區(qū)（neck region）和糖識(shí)別域（carbohydrate recognition domain，CRD）［3-5］。MBL的識(shí)別功能區(qū)是CRD，具有模式識(shí)別功能。在鈣離子存在的情況下，可以結(jié)合帶有甘露糖末端的病原分子，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，并且在MBL相關(guān)性絲氨酸蛋白酶（MASP）的作用下啟動(dòng)補(bǔ)體的凝集素途徑，產(chǎn)生補(bǔ)體活性片段，發(fā)揮溶解細(xì)菌或病毒、促進(jìn)吞噬和調(diào)節(jié)炎癥等免疫防御功能［6］。

目前高等動(dòng)物中關(guān)于MBL的研究報(bào)道很多。哺乳動(dòng)物的研究比較成熟，其MBL的兩個(gè)基因分別為MBL1和MBL2。近年來(lái)魚類的凝集素研究也逐漸增多。鮭魚凝集素是最早報(bào)道的魚類凝集素，具有抗菌和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性［7，8］。隨后從斑馬魚和鯰魚中也克隆出MBL基因［9-11］。雖然凝集素在無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫中也扮演重要角色，但其MBL研究較少，目前主要集中在文昌魚（Branchiostoma lanceolatum）和海鞘等有限的幾個(gè)種類中。其MBL的同源分子雖然也參與了補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，但是其具體作用機(jī)制不同于脊椎動(dòng)物［12］。

雜色鮑作為我國(guó)沿海重點(diǎn)養(yǎng)殖對(duì)象，隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，各種病害頻發(fā)［13-15］。本研究采用EST技術(shù)和RACE技術(shù)從體外擴(kuò)增、克隆雜色鮑甘露糖結(jié)合凝集素基因并對(duì)該基因在雜色鮑各組織中和在副溶血弧菌刺激后的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在研究雜色鮑甘露糖結(jié)合凝集素在雜色鮑免疫中的作用，加深了解鮑免疫分子機(jī)制，為鮑病害防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其處理 實(shí)驗(yàn)所需雜色鮑全購(gòu)自廈門大嶝島養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體長(zhǎng)（4.35±0.50）cm，平均體重（7.15±1.80）g，購(gòu)回后的雜色鮑暫養(yǎng)于集美大學(xué)海水試驗(yàn)場(chǎng)在有過(guò)濾層并充氧的50 L水槽中。海水每2 d一換，水溫控制在23-25℃。每2 d喂一次新鮮的江蘺。雜色鮑暫養(yǎng)馴化兩周后，用于組織取樣和細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)。

挑選性腺發(fā)育成熟的親鮑進(jìn)行人工催產(chǎn)。收集各階段幼蟲，液氮速凍過(guò)夜后，存于-80℃待用。組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)取6只健康雜色鮑，分別采集實(shí)驗(yàn)所需各組織后立即液氮速凍，存于-80℃待用。弧菌感染實(shí)驗(yàn)中，用微型注射器對(duì)雜色鮑腹足肌肉注射50 μL的副溶血弧菌菌液（實(shí)驗(yàn)組，弧菌菌液濃度為1.1× 108CFU/mL），對(duì)照組注射50 μL滅菌生理鹽水（0.8% NaCl）。注射后不同時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組取6只雜色鮑，分別收集各組織，所有樣品液氮速凍后，存于-80℃待用。

以上實(shí)驗(yàn)方法參照葛輝等［16］的研究。

1.1.2 主要試劑和儀器 本實(shí)驗(yàn)室自制的RNA抽提試劑RDP，具體配方及RNA提取過(guò)程見Chomczynski等［17］的方法。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 取出50-100 mg在-80℃保存的雜色鮑樣品組織，置于裝有1 mL RDP［17］提取液的離心管中，加入滅菌的鋼珠后用自動(dòng)勻漿儀超聲研磨至無(wú)顆粒狀懸液，靜置于冰盒10 min，使細(xì)胞充分裂解。將懸液轉(zhuǎn)移至加有預(yù)冷的200 μL CHCl3的離心管中，輕微震蕩15 s，12 000×g低溫離心10 min，取上清液移至新離心管中，加入500 μL異丙醇，低溫下放置后12 000×g低溫離心10 min。棄上清，留下離心管中白色沉淀物，加入700 μL的70%-75%乙醇洗去沉淀中的異丙醇，

12 000×g低溫離心5 min，重復(fù)洗滌2次。然后清除管中殘留乙醇后，加10-30 μL無(wú)RNA酶滅菌的雙蒸水溶解RNA沉淀。

1.2.2 cDNA第一條鏈的合成 用于實(shí)時(shí)定量PCR的cDNA第一條合成如下。在0.2 mL的PCR管中加入如下的反應(yīng)體系：加入3 μg經(jīng)過(guò)Dnase I（購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司）處理過(guò)的總RNA，1 μL的隨機(jī)引物（10 mmol/L），再加無(wú)RNA酶的雙蒸水至14 μL，輕輕混勻后，72℃，10 min，然后冰上放置5 min，破壞其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。隨后加入以下體系：4 μL 5×First-strand Buffer，1 μL dNTP Mix（10 mmol/L），1 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）（購(gòu)自Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，A3500），混合均勻。37℃下反應(yīng)90 min后將產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆?。用于RACE擴(kuò)增的cDNA第一條鏈合成同上，只是將隨機(jī)引物更換為1 μL 5' CDS primer+1 μL SMARTⅡ Oligo（10 μmol/L）或1 μL 的3' CDS primer（10 μmol/L）。制備好的cDNA第一條鏈于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RACE擴(kuò)增 第一輪PCR擴(kuò)增。采用25 μL反應(yīng)體系如下：1 μL cDNA 第一條鏈溶液，0.5 μL outer primer（10 mmol/L），2.5 μL UPM（10 μmol/L），2.5 μL 10×PCR-Buffer，0.5 μL dNTP Mix（10 mmol/L），0.5 μL Taq DNA 聚合酶，17.5 μL 雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，55-60℃ 30 s，72℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃ 5 min（所用引物見表1）。第二輪特異性擴(kuò)增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，inner和NUP為引物進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。PCR反應(yīng)體系及條件同第一輪PCR。

表1 主要引物序列

1.2.4 Head to Toe PCR方法檢測(cè)開放閱讀框的序列準(zhǔn)確性 在所獲得的perlucin基因cDNA全長(zhǎng)的5'和3'非編碼區(qū)分別設(shè)計(jì)一個(gè)正向和反向引物（即Head to tall-F和Head to tall-R，見表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ 5 min。PCR產(chǎn)物電泳后將預(yù)期大小DNA回收測(cè)序（GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA為第一條鏈，采用Real time PCR 技術(shù)對(duì)副溶血弧菌

感染后 perlucin 基因進(jìn)行表達(dá)分析。雜色鮑β-actin作為內(nèi)參基因。經(jīng)過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)引物和模板濃度比例進(jìn)行優(yōu)化后，將總反應(yīng)體積定位為20 μL，每個(gè)體系反應(yīng)包括：10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix（購(gòu)自Promega公司GoTaq qPCR Master Mix，A6001），10 μmol/L正、反引物各0.5 μL，9 μL cDNA模板。每個(gè)時(shí)相做5個(gè)樣品平行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。并對(duì)目的基因和內(nèi)參基因的熔解曲線進(jìn)行分析（所用引物見表1）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)LightCycler480 Real Time PCR System儀器自動(dòng)給出每個(gè)樣品的Cp值，計(jì)算胚胎和幼蟲發(fā)育階段及組織表達(dá)的待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量（RQ）［（待測(cè)組目的基因平均Cp值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Cp值）-（對(duì)照組目的基因平均Cp值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Cp值）］，基因表達(dá)水平用RQ平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示，并用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05（雙尾檢測(cè)法）為差異顯著。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用BLAST軟件（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列同源性比對(duì)；使用Compute pI/Mw tool（http://www.expasy.org/tools/ pi_tool.html）預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和分子質(zhì)量；利用NetNG-lyc1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGl yc/）查找糖基化位點(diǎn)（N-X-S/T）；NetPhos 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）查找磷酸化位點(diǎn)；采用SignalP3.0 Server（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）尋找信號(hào)肽；ScanProsite（http:// www.expasy.ch/tools/scanprosite/）預(yù)測(cè)二硫鍵位置；TMHMM 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TM HMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；InterProScan software（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)能結(jié)構(gòu)域；使用ClustalW軟件進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 perlucin1和perlucin4的序列分析

perlucin1 cDNA全長(zhǎng)為668 bp，包括69 bp的5'非編碼區(qū)域（untranslated region，UTR），101 bp 3' UTR和498 bp開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼165個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)編碼蛋白分子量約為18.8 kD，等電點(diǎn)約為4.57，含有2個(gè)二硫鍵、2個(gè)糖基化位點(diǎn)、13個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)C-type lectin（CTL）糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域（CRD）（圖1）。

圖1 perlucin1 cDNA全長(zhǎng)和推導(dǎo)的氨基酸序列

perlucin4 cDNA全長(zhǎng)為645 bp，包括45 bp的5' UTR，105 bp的3' UTR和495 bp的ORF，編碼164個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)編碼蛋白分子量約為18.5 kD，等電點(diǎn)約為6.09，含有2個(gè)二硫鍵、3個(gè)糖基化位點(diǎn)、10個(gè)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)CTL糖識(shí)別CRD（圖2）。

圖2 perlucin4 cDNA全長(zhǎng)和推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 perlucin1和perlucin4的同源性分析

運(yùn)用ClustalW軟件分別將perlucin1和perlucin4的蛋白序列進(jìn)行blast比對(duì)，同源性分析顯示，雜色鮑perlucin1和perlucin4與其他物種的perlucin凝集素（表2和表3）的CRD中均有6個(gè)保守的半胱氨酸，其中后面4個(gè)形成二硫鍵。結(jié)構(gòu)域中perlucin1含有“QPD”位點(diǎn)而perlucin4含有“EPN”位點(diǎn)（圖3）。

圖3 雜色鮑perlucin1（A）、perlucin4（B）和其他物種perlucin凝集素氨基酸的多重比對(duì)

表2 雜色鮑perlucin1多重比對(duì)所用到的各個(gè)物種的名字及基因序列號(hào)

表3 雜色鮑perlucin4多重比對(duì)所用到的各個(gè)物種的名字及基因序列號(hào)

2.3 perlucin1和perlucin4的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用SWISS-MODEL軟件的同源建模方法將雜色鮑Perlucin1的蛋白序列與SWISS-MODEL搜索的小鼠的mannose-binding protein C為模板（PDB：1BV4_A）進(jìn)行聯(lián)配，利用perlucin1蛋白序列C型結(jié)構(gòu)域133個(gè)氨基酸殘基構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)（圖4），其α-螺旋和β-折疊清晰可見，二者一致性為8.9%，相似度為16.1%。將perlucin4的蛋白序列與小鼠的mannose-binding protein A為模板（PDB：1YTT_ A）進(jìn)行聯(lián)配（圖5），二者的C型結(jié)構(gòu)域一致性為10.4%，相似度為18.3%。

圖4 雜色鮑perlucin1凝集素的蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖5 雜色鮑perlucin4凝集素的蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.4 perlucin1和perlucin4的mRNA組織表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR組織表達(dá)分析中，perlucin1只有在雜色鮑的消化道和肝胰腺中表達(dá)且在肝胰腺中表達(dá)量最高（圖6）。而perlucin4在雜色鮑7個(gè)組織中均有表達(dá)，且在肝胰腺中的表達(dá)量最高，其他組織中表達(dá)量較低（圖7）。

圖6 perlucin1基因的組織表達(dá)

圖7 perlucin4基因的組織表達(dá)

2.5 perucin1和perlucin4基因在弧菌感染后肝胰腺中的表達(dá)

副溶血弧菌感染雜色鮑0、4、12、24和48 h后，肝胰腺Real time PCR結(jié)果（圖8）顯示，perlucin1在弧菌感染后0-4 h無(wú)顯著性變化，而在感染12 h表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)顯著性水平（P＜0.05）。

圖8 perlucin1基因在肝胰腺中的表達(dá)

perlucin4在弧菌感染后0-4 h之間的表達(dá)量沒有顯著性變化，而在感染12-24 h，基因表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到顯著性水平（P＜0.05）。在感染48 h后，表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)（圖9）。

圖9 perlucin4基因在肝胰腺中的表達(dá)

2.6 perlucin1和perlucin4基因在胚胎發(fā)育和幼蟲時(shí)期表達(dá)分析

在胚胎和幼蟲發(fā)育過(guò)程中，perlucin1在8細(xì)胞

期之前都沒有表達(dá)，在128細(xì)胞時(shí)期表達(dá)量上調(diào)，但直到面盤幼蟲晚期之前表達(dá)量都非常低，到匍匐期表達(dá)量顯著性上調(diào)達(dá)到最高，與其它各時(shí)期形成顯著性差異（P＜0.05）（圖10）。

圖10 perlucin1胚胎和幼蟲各時(shí)期表達(dá)

perlucin4在囊胚期之前表達(dá)量極低或者沒有表達(dá)（P＜0.05）。從擔(dān)輪幼蟲早期開始表達(dá)量顯著性上升，達(dá)到最高，與卵形成顯著性差異（P＜0.05）。從面盤幼蟲中期開始表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)量急劇下降，基因表達(dá)水平一直保持在極低水平（圖11）。

圖11 perlucin4胚胎和幼蟲各時(shí)期表達(dá)

3 討論

雜色鮑屬于軟體動(dòng)物門腹足綱的無(wú)脊椎動(dòng)物，主要依靠天然免疫系統(tǒng)（innate immune system）防御病原微生物。天然免疫的免疫因子如凝集素、溶菌酶、抗菌肽、補(bǔ)體等起著非常重要的作用，這些免疫因子負(fù)責(zé)免疫識(shí)別是一類由宿主本身的胚系基因編碼的蛋白，即模式識(shí)別受體［18］。凝集素是無(wú)脊椎動(dòng)物中免疫防御的重要體液因子之一，擁有專一性受體識(shí)別因子［19］。凝集素的這種專一性識(shí)別類似于脊椎動(dòng)物的免疫球蛋白，由此可以推測(cè)在缺乏免疫球蛋白的無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，是依賴凝集素完成抗原與防御系統(tǒng)的識(shí)別的。雜色鮑perlucin只含有單個(gè)CRD，與哺乳動(dòng)物含有多個(gè)CRD的MBL分子相比，雜色鮑的MBL分子與糖配體單價(jià)結(jié)合的親和力很弱［20，21］。

雜色鮑perlucin的基因序列通過(guò)結(jié)構(gòu)分析顯示，perlucin4含有EPN位點(diǎn)而perlucin1則為QPD位。眾所周知，“ENP”為甘露聚糖結(jié)合位點(diǎn)，“QPD”為半乳糖結(jié)合位點(diǎn)［22］，這預(yù)示perlucin1可能與半乳糖結(jié)合。最近研究發(fā)現(xiàn)“EPN”和“QPD”位點(diǎn)都可以與甘露聚糖特異性結(jié)合。該現(xiàn)象最先在鯉魚的MBLs和突變的老鼠重組MBLs的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［23-25］，ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中含有“QPD”位點(diǎn)的MBLs能與板上固定的甘露糖結(jié)合，其結(jié)合效率不僅受到板上半乳糖數(shù)量影響也受到甘露糖數(shù)量的影響。而在無(wú)脊椎動(dòng)物中最早在海鞘中克隆出MBL樣凝集素GBL，它能與葡聚糖結(jié)合，具有與MBL一樣的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C-typelectin domains，CTLDs），但在N端缺乏膠原區(qū)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明也能與海鞘的 MASP 結(jié)合激活凝集素途徑，被認(rèn)為是無(wú)脊椎動(dòng)物MBLs的祖先［26］。隨后在海灣扇貝、澳洲綠唇鮑、中華絨螯蟹、凡納濱對(duì)蝦［27-30］等中均發(fā)現(xiàn)它們的MBL含有“QPD”位點(diǎn)以及受半乳糖和甘露糖抑制的現(xiàn)象，這說(shuō)明無(wú)脊椎動(dòng)物的MBL免疫模式比脊椎動(dòng)物復(fù)雜。

肝臟是哺乳動(dòng)物MBL合成的主要場(chǎng)所，也是重要的免疫器官。Real-time PCR檢測(cè)組織表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)刺激的健康雜色鮑中，perlucin1和perlucin4在組織中都有表達(dá)，并且在肝胰腺中表達(dá)量最高。而在海灣扇貝、虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰和鯉魚中發(fā)現(xiàn)MBL在肝臟和脾臟中表達(dá)量最高［11，24，31］。病原微生物入侵宿主造成機(jī)體感染、創(chuàng)傷和炎癥發(fā)生，免疫系統(tǒng)會(huì)大量合成具有防御功能的血漿蛋白、凝集素等免疫因子，這些免疫因子能使機(jī)體對(duì)修復(fù)組織損傷、抵御微生物感染等發(fā)生作用，而這些免疫因子是在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄合成的，所以肝臟是一個(gè)

重要的免疫器官。通過(guò)檢索太平洋牡蠣的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oysterdb.com/），我們發(fā)現(xiàn)雜色鮑perlucin基因與牡蠣perlucin基因相似，在整理牡蠣perlucin基因數(shù)據(jù)中，牡蠣perlucin在組織表達(dá)中消化腺中表達(dá)量最高。肝胰腺是無(wú)脊椎動(dòng)物的重要免疫器官之一，對(duì)雜色鮑而言，在它參與消化、儲(chǔ)存和代謝等生理功能，對(duì)環(huán)境變化和水媒性物質(zhì)的刺激非常敏感，在啟動(dòng)鮑免疫應(yīng)答起重要作用。

副溶血弧菌感染后，Real-time PCR結(jié)果顯示perlucin1和perlucin4基因的表達(dá)在肝胰腺中都有顯著提高，這表明perlucin1和perlucin4參與了雜色鮑免疫應(yīng)答。作為天然免疫的效應(yīng)分子，perlucin處在免疫反應(yīng)的末端，受免疫信號(hào)識(shí)別、傳遞等分子的調(diào)控。其大量表達(dá)的時(shí)相一般晚于免疫信號(hào)識(shí)別和傳遞分子［32］。雜色鮑感染副溶血弧菌后，免疫信號(hào)識(shí)別和傳遞分子顯著上調(diào)表達(dá)的時(shí)相一般是感染后3-6 h［33，34］，而免疫效應(yīng)分子上調(diào)表達(dá)的時(shí)相通常在12 h以后［32，35，36］。但是perlucin1和perlucin4的表達(dá)模式不同。前者在12 h和48 h都顯著上調(diào)，后者只在12 h上調(diào)。雖然兩者都是免疫效應(yīng)基因，但是在清除病原微生物過(guò)程發(fā)揮的作用存在差異。我們注射的是副溶血弧菌活菌，進(jìn)入雜色鮑機(jī)體的活菌能夠大量繁殖，24 h后注射部位會(huì)形成水泡囊腫［32］。因此，進(jìn)入雜色鮑機(jī)體的弧菌在經(jīng)歷免疫反應(yīng)清除后能殘存一些。這些殘存的弧菌可能是引起某些免疫效應(yīng)基因如Mpeg（巨噬細(xì)胞表達(dá)基因）等在48 h上調(diào)表達(dá)的原因［32］。Perlucin1可能與Mpeg類似，能夠響應(yīng)殘存弧菌而上調(diào)表達(dá)，而perlucin4則與DAD1和AP1類似，只在12 h或24 h時(shí)相上調(diào)表達(dá)［32，35，36］。

貝類的擔(dān)輪幼蟲和面盤幼蟲細(xì)胞分化頻繁增殖旺盛，是各種組織器官發(fā)生形成的重要階段。免疫系統(tǒng)也在這個(gè)時(shí)期逐漸形成并完善。因母體效應(yīng)而來(lái)的各種免疫基因的mRNA基本消耗殆盡，幼蟲開始自主合成免疫基因的mRNA［37-40］。Perluncin4在擔(dān)輪幼蟲和面盤早期幼蟲的高表達(dá)可能與免疫系統(tǒng)的完善有關(guān)。

雜色鮑perlucin1在胚胎和浮游幼蟲階段表達(dá)量極低，在匍匐期表達(dá)量顯著上調(diào)。匍匐階段鮑幼蟲變態(tài)為稚鮑，由浮游生活轉(zhuǎn)為底棲生活。這個(gè)階段鮑幼蟲會(huì)接觸附著基上的生物膜。生物膜由底棲硅藻、細(xì)菌等眾多微生物組成，它們的細(xì)胞壁上存在較多的糖類和糖蛋白誘導(dǎo)幼蟲的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［41-43］。研究表明凝集素參與水生動(dòng)物幼蟲的附著和變態(tài)行為，多毛類石灰幼蟲體內(nèi)的凝集素能識(shí)別海水假單胞菌細(xì)胞壁上多糖，并與之結(jié)合后誘導(dǎo)幼蟲附著變態(tài)［44］。Perlucin1的高表達(dá)可能是因接觸這些微生物的糖類所引起。此外，在匍匐階段鮑幼蟲開始攝食生物膜上的底棲硅藻，這可能也是perlucin1在該階段高表達(dá)的原因。這暗示perlucin1在幼蟲的發(fā)育中發(fā)揮著多種作用，與perlucin4的作用完全相同。

4 結(jié)論

本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，獲得兩條雜色鮑perlucin基因的cDNA編碼全序列。Real time PCR結(jié)果顯示perlucin1 和 perlucin4 參與了雜色鮑免疫應(yīng)答。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning and Expression Analysis of Two Types of perlucin Gene from Small Abalone Haliotis diversicolor

LIN Shi ZHANG Li-li WANG Guo-dong
（Fisheries College，Jimei University，Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，Xiamen 361021）

SMART RACE technology was employed to clone the full-length cDNA sequences of 2 Manna-binding lectin（MBL）members of perlucin1 and perlucin4 in Haliotis diversicolor. Real-time PCR were used to analyze their expression patterns in the different tissues of H. diversicolor. As results，the full length cDNA of perlucin1 was 668 bp，and the deduced protein was composed of 165 amino acids，with two disulfide bonds，two glycosylation sites and 13 phosphorylation sites；its predicted molecular weight was about 18.8 kD，and pI was about 4.57. The full length cDNA of perlucin4 was 587 bp and the deduced protein was composed of 156 amino acids，with two disulfide bonds，one glycosylation sites and 7 phosphorylation sites；its predicted molecular weight was about 17.8 kD，and pI was about 4.43. Gene perlucin1 and perlucin4 exclusively expressed only in hepatopancreas among 7 tissues of gill，hepatopancreas，blood lymph，up foot，mantle，mucous gland，and kidney. The above results indicate that perlucin genes involved in innate immune defense mechanisms and play a key role in immune recognition of H. diversicolor.

perlucin lectin；mannan-binding lectin；Real-time PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.019

2016-04-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41006105，41176152），福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01142），福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃（2015）

林師，男，碩士研究生，研究方向：水生生物功能基因；E-mail：linshi28227@126. com

王國(guó)棟，男，副教授，研究方向：水生動(dòng)物遺傳育種；E-mail：gdwang@jmu.edu.cn