張曉敏 成杰民(山東師范大學 山東 濟南 250014)

石油降解菌的篩選鑒定及降解石油的初步研究

張曉敏 成杰民(山東師范大學 山東 濟南 250014)

根據(jù)目前我國石油污染土壤生物修復(fù)存在缺少高效石油降解菌及降解微生物之間作用機制也不清楚等主要問題。通過室內(nèi)模擬石油污染土壤進行微生物修復(fù)試驗對菌株的石油降解效果進行驗證，篩選到高效石油降解菌株S-A-2，并對高效石油降解菌進行生理生化反應(yīng)的鑒定，經(jīng)細菌16SrDNA鑒定菌株為嗜麥芽窄食單胞菌菌株JCMS(kf724885.1)。

石油；微生物修復(fù)；石油降解菌；菌種鑒定

石油對環(huán)境污染，如今可以用危害來形容。20世紀80年代以前，治理石油污染土壤還一般運用物理和化學方法，即熱處理和化學浸出法。熱處理法可凈化土壤中大部分有機污染物，但同時也容易破壞土壤結(jié)構(gòu)和組分，并且昂貴的價格而很難廣泛接受和利用；化學浸出和水洗的除油效果也很好，但由于化學試劑的二次污染問題限制了其應(yīng)用和推廣。上世紀80年代以來，因微生物修復(fù)技術(shù)具有流程簡單、價格實惠且二次污染少等很多優(yōu)勢，因此從20世紀90年代開始，從自然界中尋找能夠快速降解某些特定污染物的微生物成為研究的熱點問題，據(jù)報道，能利用烴類的微生物約有30個屬100多種。

本試驗從石油污染土壤中分離到石油降解菌，并通過形態(tài)觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列分析對其進行鑒定，以期能為石油污染的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

試驗菌株和試驗用土均采自山東東營勝利油田油井周圍的石油污染土壤。

1.2 菌種的篩選及純化

1.2.1 富集培養(yǎng)

(1)制備土壤懸液：取土樣5g加入100ml原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，放入恒溫搖床培養(yǎng)箱中30℃、120r/min、培養(yǎng)7d，此為第一次富集。

(2)然后按6％(體積分數(shù)，下同)的接種量取上一次富集液3ml接至原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，再進行3次富集、馴化，每次培養(yǎng)7d，3次富集培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的石油質(zhì)量濃度逐步提高，依次為1.5、2.0、2.5g/L。

(3)分離石油降解菌采用稀釋平板法，將最后一次富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀釋后，取10-3、10-4、10-5四個稀釋度下的富集培養(yǎng)液，涂布在油平板上，于30℃恒溫培養(yǎng)，每個稀釋度富集液設(shè)2個重復(fù)試驗，每隔12h觀察石油降解菌的生長情況。

1.2.2 菌株的初篩

油平板上長出菌落后，挑取不同顏色和形態(tài)的優(yōu)勢單菌落，在油平板上進行多次劃線、分離、純化，以得到形態(tài)一致的純化菌株并編號；純化后的菌株保存在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上備用。

1.2.3 菌株的復(fù)篩

取純化好的菌株于100ml原油無機鹽液體培養(yǎng)基中，原油濃度為3g/L，放入恒溫搖床培養(yǎng)箱中30℃、120r/min、培養(yǎng)7d，完成最后一次馴化，將培養(yǎng)后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中備用，接種量0.1ml。

1.2.4 菌種的純化

(1)取一環(huán)最后一個周期馴化的培養(yǎng)液，在含油平板上劃線，30℃培養(yǎng)7d，反復(fù)多次。

(2)重復(fù)上述步驟，直至得到形態(tài)單一的純化菌落。

(3)純化后的菌落接種于菌種保藏培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24 h后，保存在4℃冰箱，備用。

1.3 菌種的鑒定

1.3.1 形態(tài)及生理特征鑒定

(1)對篩選出的菌種進行形態(tài)學觀察及生理生化實驗，依照伯杰氏細菌鑒定手冊，對篩選到的菌種進行鑒定，初步鑒定到屬。

(2)用顯微鏡(革蘭氏染色)觀察細菌形態(tài)學特征

(3)生理生化特征測定

1.3.2 16S rDNA全序列系統(tǒng)學分析

(1)16S rDNA的提?。壕暝?0℃ LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取1.5ml培養(yǎng)物12000 r·min-1離心，收集菌體。用細菌基因組DNA小量快速提取試劑盒進行提取(具體步驟依據(jù)產(chǎn)品說明書進行)。提取后的DNA于-20℃保存，備用。

(2)序列測定及同源性比較：16SrDNA的序列由上海生物工程股份有限公司測定。測序結(jié)果在GenBank上與已知種屬的16SrDNA進行BLAST，對獲得的同源序列進行分析并構(gòu)建進化樹。

1.4 石油降解菌降解石油效率的測定實驗

1.4.1 繪制標準曲線

稱取1g石油溶于100ml石油醚中，作為基準用油；分別稀釋至0.2、0.1、0.02、0.01、0.001、0.002g/L，用紫外分光光度計測定其吸光度，作出原油濃度—吸光度標準曲線；根據(jù)回歸曲線求得吸光系數(shù)K。

1.4.2 紫外分光光度法測定菌株降解率

(1)將一定體積的石油醚加入水樣中，蓋好瓶塞，充分振蕩。使吸附在平壁上的油漬全部溶解后，將水樣和石油醚全部轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入1：1鹽酸調(diào)制PH值小于2，用一定量石油醚清洗取樣瓶，將溶液全部轉(zhuǎn)入分液漏斗中；加入適當氯化鈉破壞乳化層以提高萃取效果。

(2)充分振蕩分液漏斗并且不斷放氣，待水樣中油質(zhì)全部溶解后，將分液漏斗放回漏斗架，使之靜置分層，放置30min以上。將水層轉(zhuǎn)入取樣瓶中，萃取液轉(zhuǎn)入100ml具塞刻度比色管中。

(3)再次將水樣轉(zhuǎn)入分液漏斗中，加入適量的石油醚，重復(fù)(2)操作，直至萃取液無色為止。收集全部萃取液與具塞刻度比色管中，加石油醚至100ml；如果萃取液渾濁，可加入無水硫酸鈉到不結(jié)塊為止，加蓋后放置30min以上，以便脫水，然后用預(yù)先以石油醚洗滌過的定性濾紙過濾，收集濾液進行比色。

(4)將被測水樣的萃取液用石油醚稀釋100倍后進行比色，裝入玻璃比色皿中，用石油醚做空白溶液在分光光度計上測量其吸光度E，波長為265mm。若萃取液顏色較深，用石油醚稀釋若干倍后進行比色。如果萃取液渾濁，可加入無水硫酸鈉到不結(jié)塊為止，加蓋后放置30min以上，以便脫水，然后用預(yù)先以石油醚洗滌過的定性濾紙過濾，收集濾液進行比色。以石油醚為參比液測定吸收值，將測得的吸收值在標準曲線上對照查得含油量，計算石油的降解率，最終選取降解率最高的一株菌作實驗用。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)測定

(1)土壤pH值測定

表1 土壤pH測定數(shù)值

由圖表可知，本實驗采取的山東東營勝利油田油井周圍土壤的PH值為8.13，偏堿性。

(2)土壤含水率及含油量的測定

表2 晾干后200ml三角瓶質(zhì)量

表3 加入10g土壤樣品后三角瓶的質(zhì)量

表4 土樣烘干后三角瓶質(zhì)量

表5 石油醚烘干后三角瓶質(zhì)量

土 壤 含 水 量 ＝(0.3684+0.3530+0.3182)/3 ＝0.3465g

土壤含水率＝(0.3465/10)*100％＝3.47％

土 壤 含 油 量 ＝(0.4563+0.3975+0.4682)/3 ＝0.4407

土壤含油率＝(0.4407/10)*100％＝4.41％

由實驗測得數(shù)據(jù)計算可得土壤含油率1.92％，土壤含水率3.47％。

(3)土壤有機質(zhì)含量的測定

空白滴定消耗硫酸亞鐵體積V0＝26.4ml

樣品滴定消耗硫酸亞鐵體積V＝21.6ml

根據(jù)1.3.3公式計算可得，土壤中有機質(zhì)含量為33.02g/kg。

2.2 高效石油降解菌的篩選與純化

(1)篩選菌株形態(tài)觀察及生理生化特征

表6 細菌形態(tài)及生理生化特征

(2)原油濃度—吸光度標準曲線的繪制

運用MATLAB2015基于最小二乘法的線性擬合方法得到該曲線，Y=0.7054*X+0.0357其中R=0.9969>99％，數(shù)據(jù)可用。由此可得，吸光系數(shù)K=0.7054。

(3)紫外分光光度法測定菌株降解石油的效率

圖1 原油降解率測定標準曲線

表7 復(fù)篩菌株降解石油的百分比

3 菌株16S rDNA序列系統(tǒng)學分析及鑒定

對獲得的同源序列進行分析并構(gòu)建進化樹：

圖2 菌株16S rDNA鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹

由實驗所得數(shù)據(jù)可知，A2的降解效率最高，因此挑選A2作為被測試菌株，編號S-A-2。

4 討論

(1)石油污染土壤樣品中分離所得菌株，用無機鹽培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩，篩選后經(jīng)平板反復(fù)劃線分離，獲得一株石油降解菌S-A-2。分析鑒定菌株經(jīng)過生理生化實驗，初步鑒定到屬，結(jié)果為單胞菌屬，再進行16S rDNA全序列系統(tǒng)學分析，確定其為嗜麥芽窄食單胞菌菌株JCMS(kf724885.1)

(2)當前石油污染狀況越來越嚴重，石油污染土壤中的微生物中細菌一般體積小、數(shù)量大、生長代謝快，相比較其他微生物有培養(yǎng)的優(yōu)勢，所以石油降解菌選擇細菌，其它的石油降解菌株是否具有更高效的降解效果還有待考究。

〔1〕Atlas R M，Atlas M C.Biodegradation of oil and bioremediation of oil spins〔J〕.Curr Opin biotechnol，1991，2(3)：440-443.

〔2〕Balba M T，Awadhi A N，Daher A R.Bioremediation of oil contaminated soil：Microbiological methods for feasibility assessment and eld evaluation 〔J〕.J Microbial Methods，1998，32(2)：155-164.

〔3〕Li Xiwu，Liu Zhipe.Microbiol biodegradation of petroleum hydrocarbons〔J〕.Acta Microbiol Sin，2002，42(6)：764-767.

〔4〕王蘭主編.環(huán)境微生物學實驗方法與技術(shù)〔M〕.化學工業(yè)出版社，2009.

〔5〕肖琳.環(huán)境微生物實驗技術(shù)〔M〕.北京：中國環(huán)境科學出版社，2004，274-277.

〔6〕中國環(huán)境監(jiān)測總站.中國土壤元素背景值〔M〕.北京：中國環(huán)境科學出版社，1983.

〔7〕孫清，陸秀君，梁成華.土壤的石油污染研究進展.沈陽農(nóng)業(yè)大學學報.2002，33(5)：390-393.

〔8〕楊革.微生物學實驗教程〔M〕.北京：科學出版社，2004：143-187.

〔9〕李穎，賈麗娜，張鵬.高效生物修復(fù)菌株的篩選及其降解能力的研究.化工環(huán)保.2004，2(增刊)：15-17.

〔10〕R.E.布坎南 N.E.吉本斯等.伯杰細菌鑒定手冊.1984：298-299.

〔11〕李慧，陳冠雄，張穎，徐慧，金寰宇，張成剛.石油降解菌的分離、鑒定及降解特性的研究.哈爾濱工業(yè)大學學報，2007，39(10)：1665-1669.

〔12〕沈德中.污染環(huán)境的微生物.化學工業(yè)出版社，2002：2-56.

Preliminary Research on Screening and Identification of Oil-degrading Bacteria and Degradation of Oil

ZhangXiaomin(Shandong Normal University JiNan ShanDong 250014)

The paper discusses the current situation of petroleum contaminated soil in China and the problems existing in microbial remediation of petroleum contaminated soil such as lack of high efficient oil degradation bacteria and the mechanism of degrading microorganisms being not clear.We obtain crude oil degradation strain with isolating and screening method and obtain strain S-A-2 by further screening according to the main components of oil.We verify oil degradation effect of the strain through indoor simulation of bioremediation experiment of oilcontaminated soil，identify the physiological and biochemical reactions of high effect oil degradation bacteria and confirm the bacteria as Stenotrophomonas maltophilia strain JCMS (KF724885.1) by bacteria 16S rDNA.

Oil Microbial remediation Oil degradation bacteria Identification of bacteria

X703.1

A

1674-263X(2016)04-0072-04

2016-12-20

張曉敏(1993-)，女，研究生，工作單位：山東師范大學。