程繽雁

（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，北京100076）

癌抗原15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立

程繽雁

（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，北京100076）

目的 建立癌抗原15-3（CA15-3）酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。方法 利用雙抗體夾心法建立CA15-3化學(xué)發(fā)光檢測體系，分別對該體系的最低檢測限、線性、分析特異性、準確度和精密度進行評估，并與進口全自動化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果進行對比。結(jié)果 本方法靈敏度為0.26 U/mL，線性范圍為0～300 U/mL，與CEA和CA125無交叉反應(yīng)，添加回收率在97.0%～105.6%之間，分析內(nèi)與分析間CV均小于10%，與進口全自動化學(xué)發(fā)光試劑同時檢測160份樣本的CA15-3濃度，檢測結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)為0.987。結(jié)論 成功建立了CA15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，在臨床應(yīng)用中可替代進口化學(xué)發(fā)光檢測試劑。

腫瘤標志物； 癌抗原15-3； 乳腺癌； 酶促化學(xué)發(fā)光法

癌抗原15-3（CA15-3）是一種粘蛋白型糖蛋白，相對分子質(zhì)量約為400000，是目前應(yīng)用最廣泛的乳腺癌血清標志物［1］。CA15-3在乳腺癌早期靈敏度不足，陽性率僅為10.1%，隨著病情進展靈敏度有所增加［2］；發(fā)生轉(zhuǎn)移時，70%的患者血清CA15-3會顯著增高［3］；乳腺癌患者在臨床治療有效的情況下，血清CA15-3測值會降低［4］。檢測血清CA15-3濃度，對乳腺癌患者療效觀察和預(yù)后估計有重要的意義。酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法具有靈敏度高、特異性好、檢測范圍寬等優(yōu)點。本工作利用雙抗夾心法建立了CA15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，對國內(nèi)乳腺癌的治療和檢測有重要的意義。

材料和儀器

1 主要儀器

化學(xué)發(fā)光儀：廈門天中達生物科技有限公司。

2 主要材料與試劑

CA15-3單克隆抗體：Hytest公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）：Sigma公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光板：NUNC公司產(chǎn)品；去激素血清、小牛血清：天津康源生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；血清樣本由北京中同藍博臨床檢

驗所提供。

3 方法

3.1 固相抗體包被板的制備 用0.02mol/L PB（pH 7.4）稀釋CA15-3單抗至終濃度為4 μg/mL，100μL/孔加入化學(xué)發(fā)光板中，置于4℃過夜。次日甩棄包被液，再加入蔗糖封閉液150μL/孔，置于37℃溫育。2h后，甩棄封閉液，將包被板自然晾干。

3.2 辣根過氧化物酶標記抗體的制備 參照郭春祥等［5］簡易高碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶（HRP）標記的 CA15-3抗體。將0.5 mg HRP溶于0.25 mL蒸餾水中，向其中緩慢滴加100 μL NaIO4（0.1mol/L）溶液，4℃攪拌20min后在HAc-NaAc緩沖液（1 mmol/L，pH 4.4）中透析過夜。次日，將碳酸緩沖液（0.0 5 mol/L，pH 9.6）透析的 CA15-3單抗緩慢滴加到活化的酶溶液中，室溫避光攪拌。2h后，加入50 μL NaBH4中止反應(yīng)，將溶液在 4℃靜置2h后轉(zhuǎn)入透析袋，在磷酸緩沖液（0.02mol/L，pH7.4）中透析過夜。次日取出，加入等體積甘油，分裝后在-20℃長期保存。

3.3 校準品的制備 用去激素血清將CA15-3純品分別稀釋為5、20、80、160、300 U/mL。用CA 15-3全自動化學(xué)發(fā)光試劑盒測定各點濃度，標識為S1～S5，作為CA15-3校準品。1 mL/瓶分裝，-20℃凍存。

3.4 分析程序 向CA15-3包被板孔中依次加入150 μL樣本稀釋液、20 μL校準品或樣品，37℃溫育30min后用洗滌液沖洗3次并拍干；每孔加入100 μL酶標抗體，37℃溫育30min后用洗滌液沖洗3次并拍干；加入100 μL發(fā)光底物液，3～10min后測量每孔光子數(shù)。以光子數(shù)為縱坐標，校準品濃度為橫坐標進行雙對數(shù)作圖，擬合校準品曲線方程。將樣本的發(fā)光計數(shù)代入方程，即可計算出樣本中CA15-3的濃度。樣本稀釋液為含20%小牛血清的磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.4）。

4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2003分析。

結(jié) 果

1 酶標抗體工作濃度的選擇

制備酶標抗體稀釋比例分別為1∶10000、 1∶20000、1∶40000、1∶80000的溶液，在包被濃度為4 μg/mL時，觀察不同濃度HRP-CA15-3對校準品曲線的影響，結(jié)果如圖1所示。根據(jù)校準品曲線的線性相關(guān)系數(shù)，選擇酶標抗體的工作濃度為1∶20000。

2 包被濃度的選擇

制備包被濃度分別為 2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL的CA15-3固相抗體板，HRP-CA15-3濃度為1∶20000時，觀察不同包被濃度對校準品曲線的影響，結(jié)果如圖2所示。包被濃度為4 μg/mL和8 μg/ mL時，校準品曲線的線性相關(guān)系數(shù)均為0.999，以節(jié)約原料為原則，選擇包被濃度為4 μg/mL。

3 反應(yīng)條件的確定

3.1 加樣量 樣本稀釋液加樣體積為150 μL

時，選取10 μL、20 μL、50 μL校準品加樣體積進行對比分析，結(jié)果如圖3所示?？紤]到加樣準確性和校準品曲線的線性相關(guān)系數(shù)，本分析方法選用20 μL校準品，150 μL樣本稀釋液進行反應(yīng)。

3.2 反應(yīng)時間 本分析方法采用兩步法，加入稀釋液和樣本后分別溫育0.5h、1h、2h、3h、4h，在第二步溫育1h時，對比分析第一步反應(yīng)溫育時間對發(fā)光計數(shù)的影響。由圖4可以看出，第一步反應(yīng)0.5h即可達到平衡，故選取第一步溫育時間為0.5h。在第一步溫育0.5h時，加入酶標抗體分別溫育0.5h、1h、2h、3h，對比分析第二步溫育時間對發(fā)光計數(shù)的影響。由圖5可以看出，第二步反應(yīng)0.5h也可達到平衡。故本分析方法選取0.5h+0.5h的反應(yīng)模式，滿足了市場快速檢測的需求。

4 方法學(xué)鑒定

4.1 校準品曲線及最低檢測限 同時測定20孔S0，計算其發(fā)光計數(shù)（RLU）的均值x和標準差s，以x±2s為Y值，代入校準品曲線公式，計算出相對應(yīng)的濃度值為0.26 U/mL，即為本方法的最低檢測限。

4.2 線性 將一份CA15-3高值樣本用樣本稀釋液倍比稀釋，測定值如表1所示。稀釋度與測定值的相關(guān)方程為 Y=1232.9X+5.8，r=0.998，表明本分析方法在0～300 U/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。樣本稀釋曲線如圖6所示。

表1 不同稀釋倍數(shù)血樣測定結(jié)果（U/mL）

4.3 分析特異性 用去激素血清分別配制濃度為1000 ng/mL的CEA和1000 U/mL的CA125溶液，本方法測定結(jié)果分別為0.18 U/mL和0.22 U/mL。

4.4 準確度 向兩份含不同濃度CA15-3的血清中加入已知量的校準品，對其測量并計算添加回收率，即為本分析系統(tǒng)的準確度。實驗結(jié)果如表2和表3所示。本方法的回收率為97.0%～105.6%。

表2 1#樣本添加回收實驗（U/mL）

表3 2#樣本添加回收實驗（U/mL）

4.5 分析內(nèi)與分析間精密度 對高、中、低三份樣本，分別在同次實驗中平行測量20孔，計算分析內(nèi)精密度；分別在10次實驗中重復(fù)測量，計算分析間精密度。結(jié)果如表4和表5所示。

表4 分析內(nèi)精密度結(jié)果（n=20，U/mL）

表5 分析間精密度結(jié)果（n=10，U/mL）

4.6 相關(guān)性實驗 使用ADVIA Centaur CA15-3 ReadyPack全自動化學(xué)發(fā)光試劑（西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司，批號：043160）與本方法同時測定160份樣本的CA15-3濃度，相關(guān)性見圖7，相關(guān)性方程為：Y=0.968X+1.538，r=0.987。

結(jié) 論

血清CA15-3含量對乳腺癌患者的療效觀察和預(yù)后估計具有重要的意義。本研究利用雙抗體夾心法研制的CA15-3酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，最低檢測限為0.26 U/mL，在0～300 U/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，與高濃度CEA和CA125無交叉反應(yīng)，分析內(nèi)、分析間CV均小于10%，與進口全自動化學(xué)發(fā)光試劑檢測結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)為0.987。此外，本試劑盒無需進行樣本稀釋，方便臨床檢驗操作；反應(yīng)時間僅需一小時，能夠滿足快速檢測的市場需求。在臨床工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Duffy M J，Evoy D，McDermott E W.CA15-3：Uses and limitation as a biomarker for breast cancer.Clin Chim Acta，2010，411（23-24）：1869-1874.

［2］Sandri M T，Salvatici M，Botteri E，et al.Prognostic role of CA15.3 in 7942 patients with operable breast cancer.Breast Cancer Res Treat，2012，132（1）：317-326.

［3］Ohuchi N，Sato S，Akimoto M，et al.The correlation between the immunohistochemical expression of DF3 antigen and serum CA15-3 in breast cancer patients.Jpn J Surg，1991，21（2）：129-137.

［4］Brouckaert O，Laenen A，Wildiers H，et al.The prognostic role of preoperative and（early）postoperatively change in CA15.3 serum levels in a single hospital cohort of primary operable breast cancers.Breast，2013，22（3）：254-262.

［5］郭春祥，郭錫瓊.介紹一種簡單、快速、高效的辣根過氧化物酶標記抗體的過碘酸鈉法.上海免疫學(xué)雜志，1983，3（2）：97-100.

（張增武編輯）

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《標記免疫分析與臨床》雜志社

2016年10月18日

Development of a Chemiluminescent Immunoassay for Cancer Antigen 15-3

CHENG Bin-yan
（Beijing North Institute of Biological Technology，Beijing100076，China）

Objective To evaluate using chemiluminescent immunoassay（CLIA）system to detect serum cancer antigen 15-3（CA 15-3）.Methods The system was evaluated in its limit of detection，linearity，analytical specificity，accuracy and repetitiveness.A total of 160 clinical specimens were detected and evaluated.Results The limit of detection was 0.26 U／mL and the recovery rate for accuracy was 97.0%-105.6%.The assay had a good linear relationship between 5-300 U／mL and had no cross reaction with CEA and CA125.All samples were detected by two CLIA systems，and the results were consistent and trusted.Conclusion The CLIA system for detecting CA15-3 has been established，which has satisfied sensitivity，repeatability，and will be widely used in clinical testing.

Tumor marker； Cancer antigen 15-3； Breast cancer； Chemiluminescence enzyme immunoassay

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.031

2016-05-20；

2016-06-11