葉蕓++張建坤++王琴++徐雪++王振華

摘要：比較了油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑脛病菌（L. biglobosa）在不同培養(yǎng)溫度和2種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，在PDA和V8培養(yǎng)基平板上都生長(zhǎng)良好，油菜莖基潰瘍病菌培養(yǎng)溫度在28 ℃時(shí)，油菜黑脛病菌培養(yǎng)溫度在25 ℃或28 ℃時(shí)，在PDA平板上菌絲生長(zhǎng)最好；油菜黑脛病菌與油菜莖基潰瘍病菌菌落生長(zhǎng)速度相比，在最適培養(yǎng)溫度（25 ℃或28 ℃）和相同的培養(yǎng)時(shí)間 （21 d）內(nèi)，二者在PDA平板上的菌落生長(zhǎng)速度分別為5～7 mm/d和2.0 mm/d，前者的菌落直徑約90 mm，是后者的2倍。因此，在溫度為25 ℃或28 ℃的條件下，PDA培養(yǎng)基最適合這2種病菌的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）；油菜黑脛病菌（L. biglobosa）；菌絲生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)：S435.654 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）18-4708-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.021

油菜莖基潰瘍病菌（Leptosphaeria maculans）和油菜黑脛病菌（L. biglobosa）均為莖點(diǎn)霉屬真菌，可引起油菜嚴(yán)重的病害[1-6]。由于頻繁的油菜國(guó)際間貿(mào)易，黑脛病原菌目前已擴(kuò)散到世界多數(shù)油菜生產(chǎn)國(guó)，導(dǎo)致病害的發(fā)生。油菜的子葉、真葉、莖稈、根以及莢果等都有可能被黑脛病原菌侵染，其中以葉片和莖基部的感染癥狀最為常見(jiàn)[6]。油菜莖基潰瘍病菌可在十字花科植物上廣泛傳播，在葉片和莖稈上形成典型的莖點(diǎn)病斑，繼而在主莖及分枝上形成黑色的條狀莖腐病斑，造成幼苗或成株死亡，導(dǎo)致菜子產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[4，7]?，F(xiàn)已成為世界性的重要病害。為此，本試驗(yàn)對(duì)這2種病菌在不同培養(yǎng)平板上的培養(yǎng)特征進(jìn)行了研究，以便找到快速培養(yǎng)這2種病菌的方法[2，5]。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本試驗(yàn)所用油菜黑脛病菌XGL-1、SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）菌株為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李國(guó)慶教授所提供。油菜莖基潰瘍病菌的陽(yáng)性對(duì)照分離物為湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局收藏的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 60737。

1.2 菌株的分離純化

將菌株ATCC 60737、XGL-1、SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）直徑5 mm的菌絲碟片接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板中央，于25 ℃培養(yǎng)，10～15 d后挑取其產(chǎn)生的分生孢子器，在20 ℃下進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察菌絲的生長(zhǎng)狀況。

1.3 油菜黑脛病菌最適生長(zhǎng)溫度的篩選

在活化14 d的SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）的PDA培養(yǎng)基平板邊緣取直徑5 mm的菌絲碟片，分別接種于PDA培養(yǎng)基平板中進(jìn)行不同溫度的恒溫黑暗培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)溫度梯度，4、10、15、25、30 ℃，每個(gè)溫度每種菌株5皿，每3～5 d觀察記錄菌絲的生長(zhǎng)狀況，取平均值。

1.4 兩種病菌生長(zhǎng)速度比較

在活化14 d的ATCC 60737、XGL-1的PDA培養(yǎng)基平板邊緣取直徑5 mm的菌絲碟片，分別接種于PDA和V8培養(yǎng)基平板中進(jìn)行不同溫度的恒溫黑暗培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)溫度梯度15、20、25、28 ℃，每個(gè)溫度每種菌株5皿，每3～5 d觀察記錄菌絲的生長(zhǎng)狀況，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜黑脛病菌最適生長(zhǎng)溫度篩選

不同油菜植株部位分離的油菜黑脛病菌菌株SS-13（根）、10ZJ-1（莖）、SYL-2B（葉）在5個(gè)溫度（4、10、15、25、30 ℃）、黑暗、PDA平板上的菌絲生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖1。由圖1可知，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，菌落擴(kuò)展速度約為5.0 mm/d。同種培養(yǎng)條件下，分離自根部的菌株（SS-13）菌絲生長(zhǎng)最快，但各菌株的菌落擴(kuò)展速度無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，油菜黑脛病菌不同部位分離的菌株在油菜生長(zhǎng)期均可侵染，該病菌在離體條件下生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)初期產(chǎn)生絨毛狀白色菌絲，呈直線式生長(zhǎng)，產(chǎn)生很少短的分枝，菌落規(guī)則，分生孢子器主要形成于菌落中央，菌絲的氣生部分形成黃色或褐色液體小滴，在PDA培養(yǎng)基上釋放深棕色色素。

2.2 油菜莖基潰瘍病菌ATCC 60737在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度

油菜莖基潰瘍病菌在4個(gè)不同溫度下黑暗培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該病菌在PDA和V8平板上生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速度較穩(wěn)定，在平板上釋放黑色色素，形成白色平坦菌落，氣生菌絲短小，有較多的分支菌絲，形成分生孢子器相對(duì)較少。當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，該病菌的菌落在PDA平板上擴(kuò)展速度約為1.8 mm/d，在V8平板上約為1.4 mm/d；當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，該菌落在PDA平板上擴(kuò)展速度增加至2.0 mm/d，在V8平板上擴(kuò)展速度增加至1.8 mm/d。因此，油菜莖基潰瘍病菌的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（圖2）。

2.3 油菜黑脛病菌XGL-1在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度

油菜黑脛病菌在PDA和V8平板上均能生長(zhǎng)，但在相同時(shí)間和相同培養(yǎng)溫度下菌落在PDA平板上擴(kuò)展速度大于在V8平板上的擴(kuò)展速度。18 d后PDA平板上的菌落直徑最大，21 d后V8平板上的菌落直徑達(dá)到最大。XGL-1在PDA平板上菌落的擴(kuò)展速度約為5～7 mm/d，在V8平板上菌落的擴(kuò)展速度約為3.5～4.5 mm/d。XGL-1在V8平板上的生長(zhǎng)速率小，氣生菌絲更發(fā)達(dá)，菌絲擴(kuò)展不均勻，菌落形狀不規(guī)則，菌絲的氣生部分形成淡棕色油狀液滴，菌絲在平板中部集中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)后期V8培養(yǎng)基顏色呈黑褐色（圖3）。

2.4 兩種病菌在最適溫度的PDA培養(yǎng)基上的擴(kuò)展速度比較

油菜黑脛病最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃和28 ℃，油菜莖基潰瘍病菌最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)基均為PDA培養(yǎng)基。在培養(yǎng)溫度為25 ℃或28 ℃時(shí)，相同培養(yǎng)時(shí)間下油菜黑脛病菌菌落的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于油菜莖基潰瘍病菌，培養(yǎng)18 d后，油菜黑脛病菌的菌落直徑達(dá)到最大，近90 mm，而油菜莖基潰瘍病菌菌落直徑不足其一半（圖4）。

3 小結(jié)與討論

油菜莖基潰瘍病菌對(duì)油菜表現(xiàn)為強(qiáng)致病性，在離體條件下生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，培養(yǎng)物表面呈暗灰色；油菜黑脛病菌對(duì)油菜表現(xiàn)為弱致病性，在離體條件下生長(zhǎng)較快，產(chǎn)生絨毛狀白色菌絲，呈直線式生長(zhǎng)，很少產(chǎn)生短的分枝，菌落規(guī)則，分生孢子器主要形成于菌落中央，可產(chǎn)生大量子座和孢子，菌絲的氣生部分形成黃色或褐色液體小滴，在PDA培養(yǎng)基上釋放深棕色色素。在顯微鏡下可觀察到XGL-1的孢子呈長(zhǎng)梭形，兩端各有一個(gè)油滴狀的透明物。油菜莖基潰瘍病菌菌落邊緣不整齊、有結(jié)節(jié)狀顆粒點(diǎn)，氣生菌絲白色、多而致密，分枝較多，有分隔，分生孢子器球形至扁球形，褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌絲中，分生孢子無(wú)色透明，橢圓形至紡錘形，兩端常見(jiàn)各1個(gè)油球，培養(yǎng)物表面有黑色色素生成。

油菜黑脛病菌和油菜莖基潰瘍病菌在PDA或V8培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)良好，但生長(zhǎng)速度相差明顯。油菜黑脛病菌的最適生長(zhǎng)溫度為25和28 ℃，在PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度為5～7 mm/d；油菜莖基潰瘍病菌的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，在PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度為2.0 mm/d。

油菜莖基潰瘍病菌和黑脛病菌的試驗(yàn)表明，在湖北省內(nèi)油菜黑脛病菌可能廣泛存在，應(yīng)引起有關(guān)部門的重視，加強(qiáng)油菜黑脛病的防治力度，避免油菜黑脛病的大發(fā)生[3]。油菜莖基潰瘍病菌ATCC 60737的培養(yǎng)溫度與油菜黑脛病菌XGL-1基本一致。因此，作為檢疫性的病原菌，如果傳入中國(guó)，其定殖、病害發(fā)生與流行就具有理論上的可能性。

參考文獻(xiàn)：

[1] WILLIAMS R H，F(xiàn)ITT B D L. Differentiating A and B groups of Leptosphaeria maculans，causal agent of stem canker （blackleg） of oilseed rape[J].Plant Pathology，1999，48（2）：161-175.

[2] 王振華，趙 暉，宋 祺，等.加拿大進(jìn)境油菜籽加工過(guò)程中油菜莖基潰瘍病菌的檢測(cè)與鑒定[J].植物檢疫，2010，24（6）：25-26.

[3] 王振華，楊 武，趙 暉，等.加拿大進(jìn)境油菜籽莖基潰瘍病菌的檢測(cè)與鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：66-69.

[4] SIVASITHAMPARAM K，BARBETTI M J，LI H. Recurring challenges from a necrotrophic fungal plant pathogen：A case study with Leptosphaeria maculans（causal agent of blackleg disease in brassicas） in Western Australia[J].Ann Bot，2005，96（3）：363-377.

[5] MORENO-RICO O，F(xiàn)RIAS-TREVI？譙O A G，LUNA-RUIZ J J，et al. Characterization and pathogenicity of isolates of Leptosphaeria maculans from Aguascalientes and Zacatecas，Mexico[J].Can J Plant Pathol，2001，23（3）：270-278.

[6] FITT B D L，BRUN H，BARBETTI M J，et al. World-wide importance of phoma stem canker（Leptosphaeria maculans and L. biglobosa） on oilseed rape（Brassica napus）[J].European Journal of Plant Pathology，2006，114（1）：3-15.

[7] SPRAGUE S J，WATT M，KIRKEGAARD J A，et al. Pathways of infection of Brassica napus roots by Leptosphaeria maculans[J].New Phytologist，2007，176（1）：211-222.