董志勇 李建平徐靜 王冠梁黃曉剛林偉

肝細(xì)胞癌（heptocellular carcinoma，HCC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌發(fā)病率約為25.7/10萬(wàn)，其中HCC占肝癌的80%以上，死亡率僅次于胃癌和肺癌［1，2］。甲胎蛋白（alpha fetal protein，AFP）是目前唯一推薦用于HCC監(jiān)測(cè)的血清標(biāo)志物［3］，但近年有研究發(fā)現(xiàn)高爾基蛋白-73（Golgi protein-73，GP73）在 HCC患者血清中顯著增高，其診斷HCC的敏感度和特異度均高于 AFP，可能是 HCC 早期診斷的更好標(biāo)志物［4，5］。本研究采用Western blot法檢測(cè)HCC患者血清中GP73的表達(dá)水平，探討GP73對(duì)HCC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2012年8月至2015年1月于莆田學(xué)院附屬醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的31例HCC患者為HCC組，其中男性26例，女性5例；年齡50～70 歲，平均年齡（61.35±5.68）歲。所有患者均為符合巴塞羅那臨床肝癌分期系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)的早期HCC［6］，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表面抗原均陽(yáng)性；肝功能正?；駽hild-Pugh分級(jí)為A級(jí)；無(wú)合并其他腫瘤和嚴(yán)重心肺功能異常等。同時(shí)選取同期于莆田學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的31名健康志愿者為健康對(duì)照組，其中男性18名，女性 13名；年齡 50～70歲，平均年齡（58.35±6.40）歲，HBV表面抗原均陰性，肝功能生化指標(biāo)檢測(cè)正常，無(wú)其他系統(tǒng)疾病。兩組入組前均簽署知情同意書(shū)，且兩組性別、年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 標(biāo)本采集

抽取待檢者清晨空腹靜脈血2 mL置于加抗凝劑試管中，室溫靜置1 h，5 000 r/min離心5 min，分離血清后置-20℃冰箱保存，備用。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 主要設(shè)備及試劑 GP73蛋白檢測(cè)試劑盒（熱景生物技術(shù)有限公司），Western blot裝置（Bio-Rad公司），PVDF膜（博光科技公司），5415D低溫離心機(jī)（Heraus公司），小型電泳儀PAC-300（Bio-Rad公司），Multi-analytist成像系統(tǒng)（G：BOX），TS-I型脫色搖床（林貝爾儀器制造有限公司），垂直電泳槽（Bio-Rad公司）；Anti-GP73鼠單抗、Anti-鼠二抗（BD公司）。MOPs電泳緩沖液、TBST緩沖液、PBS、紅細(xì)胞裂解液、DMEM培養(yǎng)基等。

1.3.2 Western blot法檢測(cè)GP73蛋白的表達(dá) 取待測(cè)血清 4 μL加入 1×上樣緩沖液 76 μL，100℃滅活 5 min。4%～12%丙烯酰胺梯度預(yù)制膠和MOPs電泳緩沖液進(jìn)行電泳，上樣量為每孔10 μL，含0.5 μL血清。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜：4%牛奶室溫封閉1 h后置于雜交膜內(nèi)，加GP73 鼠單抗（1∶2 000）或 GP73 多抗（1∶1 000），4℃搖床孵育12 h。TBST洗脫3次，每次10 min；加Anti-鼠二抗（1∶10 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗脫 3 次，每次10 min，ECL暗室曝光。取最好的3次結(jié)果使用Image quant 5.2軟件分析各條帶的灰度值。以待測(cè)樣品灰度值與標(biāo)準(zhǔn)正常血清灰度值的比值設(shè)為GP73的相對(duì)單位，采用GP73蛋白檢測(cè)ROC曲線某一較佳截?cái)嘀祵?duì)應(yīng)的灰度值來(lái)計(jì)算陽(yáng)性率和陰性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS l3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。因數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，兩組比較采用Mann Whitney檢驗(yàn)。陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)。制作受試者工作特征曲線（ROC），同時(shí)報(bào)告曲線下面積及95%可信區(qū)間，計(jì)算GP73診斷HCC的敏感度、特異度和ROC曲線下面積。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清GP73檢出率的比較

HCC組和健康對(duì)照組GP73蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為 74.19%（23/31）和 9.68%（3/31），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.50，P＜0.001）。HCC 組與健康對(duì)照組GP73蛋白檢測(cè)值分別為5.2（2.1～6.9）RU和1.1（1.0～1.6）RU，HCC組約為健康組的 4.7 倍，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 血清GP73診斷HCC的效能

在ROC曲線中，盡量取靠近左上角的截?cái)嘀底鳛樵\斷標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)的敏感度和特異度較好。在GP73 ROC曲線上取2.3 RU（GP73濃度為82.2 ng/mL）為截?cái)嘀禃r(shí)，ROC曲線下面積為0.823（95%CI：0.71～0.93），GP73檢測(cè)HCC的敏感度和特異度達(dá)到最佳，分別為90%和78%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清GP73診斷HCC的ROC曲線

3 討論

目前認(rèn)為AFP是診斷HCC的重要標(biāo)志物，已廣泛應(yīng)用于臨床，但仍有部分患者AFP檢測(cè)結(jié)果呈陰性。因此，臨床檢測(cè)中引入新的標(biāo)志物，對(duì)HCC的診斷具有重要意義。Marrero等［7］一項(xiàng)回顧性分析發(fā)現(xiàn)，AFP作為早期HCC診斷標(biāo)志物的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為9%～32%，敏感度為39%～64%，特異度為76%～91%。GP73是2000年由Kladney等［8］研究成人巨細(xì)胞性肝炎病原學(xué)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的在高爾基體里存在的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73主要由膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，正常肝細(xì)胞表達(dá)很少甚至不表達(dá)，但在肝臟急性炎癥或較嚴(yán)重的肝纖維化時(shí)，GP73表達(dá)明顯上調(diào)，肝硬化時(shí)表達(dá)進(jìn)一步升高，肝癌時(shí)達(dá)到高峰［9，10］。因此有學(xué)者推測(cè)GP73可能是診斷HCC更理想的標(biāo)志物［11］。進(jìn)一步研究［12～14］證實(shí)血清GP73在診斷HCC中較AFP具有更好的敏感度和特異度，可作為診斷HCC的一個(gè)可靠標(biāo)志物。本研究采用Western blot法檢測(cè)血清中GP73的表達(dá)情況，結(jié)果HCC組患者陽(yáng)性表達(dá)率及其表達(dá)量均顯著高于健康對(duì)照組，與國(guó)內(nèi)外研究［15，16］報(bào)道結(jié)果一致。這種機(jī)制可能是GP73被前蛋白水解酶弗林水解酶裂解其遠(yuǎn)端第55個(gè)氨基位點(diǎn)，形成分泌型GP73，運(yùn)輸至細(xì)胞外，進(jìn)入血清中，從而致使HCC患者血清中GP73表達(dá)水平上調(diào)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)設(shè)定血清GP73濃度82.2 ng/mL為診斷臨界值時(shí)，ROC曲線下面積為0.823，其檢測(cè)HCC的敏感度和特異度均達(dá)到最優(yōu)，分別為90%和78%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道［14，17］結(jié)果一致，亦優(yōu)于上述研究報(bào)道的AFP檢測(cè)的敏感度與特異度，提示GP73在HCC診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GP73在HCC中表達(dá)升高，在診斷HCC中具有較高的敏感度和特異度，有望成為HCC的診斷標(biāo)志物。但由于本研究病例數(shù)較少，且未納入肝硬化、乙型和丙型病毒性肝炎患者進(jìn)行分析，可能存在一定選擇性偏倚；未檢測(cè)AFP及其與GP73聯(lián)合檢測(cè)的效能，無(wú)法確定聯(lián)合檢測(cè)是否更優(yōu)；未與ELISA、RT-PCR等檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比較，無(wú)法確定檢測(cè)技術(shù)是否存在差異。因此，本研究結(jié)論有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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