孫盛明，朱健,*，戈賢平，張成鋒，繆凌鴻，張武肖，章瓊

1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，無錫214081

2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫214081

團(tuán)頭魴谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其在氨氮脅迫中的表達(dá)分析

孫盛明1，朱健1,*，戈賢平1，張成鋒1，繆凌鴻1，張武肖2，章瓊2

1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，無錫214081

2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫214081

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)是一類多功能蛋白家族,主要參與解毒和抗氧化防御過程。為了研究GST在團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)肝臟解毒過程中的作用,克隆并分析了團(tuán)頭魴1個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(命名為MaGST)cDNA序列,采用實時熒光定量PCR研究了其在氨氮脅迫下的表達(dá)規(guī)律。MaGST包含1個長218個氨基酸的完整開放閱讀框,具有GST蛋白家族的保守堿基和保守結(jié)構(gòu)域。通過MEGA 5.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),團(tuán)頭魴GST與其他動物mu型GST聚為一簇,表明團(tuán)頭魴GST屬于mu型GST。熒光定量PCR結(jié)果顯示MaGST基因在團(tuán)頭魴各組織中均有表達(dá),在肝臟和鰓中表達(dá)量最高,肌肉中表達(dá)量最低,同時在氨氮脅迫過程中該基因在肝和鰓中的表達(dá)規(guī)律相似,均在脅迫期間表達(dá)量顯著上調(diào)；氨氮脅迫24 h時鰓和肝組織均存在組織損傷。研究結(jié)果提示在團(tuán)頭魴肝臟和鰓組織中GST基因參與了氨氮脅迫的解毒過程。將該基因的編碼區(qū)重組到pET-21(a+)載體后在大腸桿菌中得到誘導(dǎo)表達(dá),重組MaGST的GST活力為(10.36±0.68)U·mg-1蛋白。

氨氮脅迫；團(tuán)頭魴；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；基因克隆

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國大宗淡水魚類主要養(yǎng)殖品種之一。然而,隨著團(tuán)頭魴集約化養(yǎng)殖密度和規(guī)模的擴(kuò)大,其發(fā)病率明顯增高,而水體中氨氮含量過高是促使其發(fā)病的主要影響因素之一,嚴(yán)重制約了團(tuán)頭魴高密度養(yǎng)殖模式的發(fā)展[1]。已有研究表明氨氮脅迫對魚類的影響主要集中在生長性能[2-3]、鰓增生[4]和氧化損傷脂質(zhì)和蛋白質(zhì)[5]等幾個方面,而目前有關(guān)團(tuán)頭魴對水環(huán)境氨氮脅迫的去毒分子機(jī)理、代謝機(jī)制等研究尚未見報道。

水生生物解毒過程被分為3個階段,階段Ⅰ與階段Ⅱ能夠?qū)⑼庠葱曰瘜W(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成毒性較小的水溶性代謝物,階段Ⅲ在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)消除這些代謝產(chǎn)物[6]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST,EC.2.5.1.18)作為主要的第二相解毒酶(phaseⅡdetoxification enzyme)參與了外源性或內(nèi)源性毒素的解毒過程,它可以催化親核性的谷胱甘肽與各種親電子外源化學(xué)物的結(jié)合反應(yīng),參與維持了機(jī)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡,從而提高機(jī)體對環(huán)境的適應(yīng)能力以及成活率[7]。文獻(xiàn)報道GST參與細(xì)胞耐菌性、植物抗除草劑和昆蟲抗藥性等分子過程[8-10],上述研究表明GST在動植物解毒、抗逆和抗病過程中起著重要作用。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是一組廣泛分布于各類生物細(xì)胞的超家族酶類[11],哺乳動物中目前報道的GST主要分為細(xì)胞質(zhì)GSTs(包括7個類型Alpha、Mu、Pi、Theta、Sigma、Omega和Zeta)、線粒體GST (kappa)和微粒體GST[12]。鑒于魚類中抗氧化分子如谷胱甘肽或抗氧化物酶如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶能夠保護(hù)機(jī)體氧化損傷,近年來魚類不同亞型的GST基因cDNA全序列已相繼被克隆[13-15],而關(guān)于草食性魚類團(tuán)頭魴GST基因的克隆與表達(dá)研究未見報道。本研究以實驗室前期構(gòu)建的團(tuán)頭魴全組織cDNA文庫中篩選出的EST序列為基礎(chǔ),通過RACE技術(shù)獲得了團(tuán)頭魴谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的全長序列,采用熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在團(tuán)頭魴氨氮脅迫下的表達(dá)模式。采用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的重組表達(dá)產(chǎn)物,檢測了重組蛋白的活性,以期為團(tuán)頭魴功能基因開發(fā)及解毒系統(tǒng)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚

團(tuán)頭魴幼魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地。選擇活潑健康、規(guī)格一致的團(tuán)頭魴幼魚(15±0.86)g共300尾,試驗開始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)2周,每天投喂3次(08:00、11:30和17:00),根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整投喂量,實驗前提前2天停止投喂飼料。整個試驗期間水質(zhì)如下:水溫為23～24℃,溶氧≥5mg·L-1,pH為6.8～7.2。通過本實驗室預(yù)實驗得出團(tuán)頭魴幼魚96 h氨氮半致死濃度的基礎(chǔ)上[16],設(shè)計低氨氮組(對照組0.46mg·L-1)和高氨氮組(25mg·L-1),每個處理設(shè)置3個平行,用氯化銨為母液配制實驗組的總氨氮濃度。挑選體色正常、健康的團(tuán)頭魴幼魚隨機(jī)放入6個可控溫循環(huán)流水圓形蓄養(yǎng)槽(規(guī)格為φ820 mm×700 mm)內(nèi),每桶40尾。實驗期間停止喂食,每隔4小時進(jìn)行總氨氮濃度的測定。

1.1.2 試劑和儀器

RNAiso Plus、3’-Full RACE Kit、5’-Full RACE Kit、LA Taq TM、pMD 18-T Vector、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq TM、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa；分析純NH4Cl、苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)、氯仿、異丙醇、DEPC水、Tryptone、Yeast extract、NaCl、Agar、氨芐青霉素、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自Sangon Biotech；引物由上海生工合成。低溫離心機(jī)(湘儀TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī))、凝膠成像系統(tǒng)(Beckman Coulter CEQ 8000)、紫外分光光度計(eppendorf BioPhotometer)、PCR儀(eppendorf Autherized Thermal cycler)、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System)、搖床(華利達(dá)HZ-9511K恒溫振蕩器)、熒光顯微鏡(奧林巴斯)、德國徠卡切片機(jī)(Leica RM 2135)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取

取團(tuán)頭魴肝組織轉(zhuǎn)入液氮預(yù)冷的研缽中,邊磨邊加入液氮,迅速將組織研磨成粉末狀,RNA提取方法按照RNAiso Plus的操作步驟進(jìn)行組織裂解后用傳統(tǒng)的酚仿抽提法提取總RNA并使用RNA-free DNaseI純化試劑盒用于各組織總RNA的純化,紫外分光光度計測定RNA濃度及純度并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織總RNA的完整性。

1.2.2 GST3’端和5’端擴(kuò)增

從本實驗室構(gòu)建的團(tuán)頭魴肝臟cDNA文庫的測序結(jié)果中,通過拼接組裝及比對分析,從中發(fā)現(xiàn)1條EST序列(長度為756 bp)與鯉魚(Cyprinus carpio)的GST(ABD67509.1)氨基酸序列相似度較高,根據(jù)已知中間序列,采用 Primer 5.0軟件分別設(shè)計5′RACE和3′RACE的特異性引物(詳見表1),以團(tuán)頭魴肝臟cDNA為模板,按照3'RACE和5'RACE試劑盒(Takara,大連)說明書分別進(jìn)行3’和5’的擴(kuò)增。

1.2.3 序列分析

使用ContigExpress軟件將團(tuán)頭魴GST的中間序列、3’測序結(jié)果、5’測序結(jié)果進(jìn)行拼接得到該基因的全長cDNA序列。在Compute pI/Mw程序中預(yù)測蛋白分子量及等電點(http://web.expasy.org/compute _pi/)。登陸NCBI,在該網(wǎng)站中的ORF Finder程序中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找所拼接團(tuán)頭魴GSTcDNA序列的開放閱讀框及其所對應(yīng)的氨基酸序列,同時對開放閱讀框進(jìn)行Blastp比對,運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對分析,利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用NCBI的Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查找工具分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 團(tuán)頭魴不同組織GST的表達(dá)分析

提取團(tuán)頭魴肌肉、鰓、腎、腦、肝、腸道6個組織的總RNA,熒光定量PCR反應(yīng)的cDNA合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn),根據(jù)所獲得的GST基因全長cDNA序列設(shè)計1對熒光定量特異引物MaGST qF和MaGST qR(見表1),擴(kuò)增長度為151 bp；以團(tuán)頭魴的β-actin基因(序列號AY170122)為熒光定量反應(yīng)的內(nèi)參基因,設(shè)計1對內(nèi)參引物β-actin-F和β-actin-R (見表1)。對熒光定量基因特異性引物和內(nèi)參引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,用瓊脂糖檢測其在團(tuán)頭魴中的擴(kuò)增情況,判斷目的片段的大小并檢測其正確性。

表1 基因克隆所用的引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in gene cloning

熒光染料使用Takara的SYBR?Premix Ex Taq II,反應(yīng)在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System定量儀上進(jìn)行,按照試劑盒上的說明加樣,反應(yīng)總體系為20μL,內(nèi)含cDNA 2μL、引物各0.8μL(10μmol·L-1)、SYBR?Premix Ex Taq II 10μL、ROX Reference Dye or Dye II 0.4μL、dH2O 6μL,采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)程序為95℃30 s、95℃5 s、60℃34 s,共40個循環(huán)。每個樣品3次重復(fù)實驗以減少誤差,先用標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行定量PCR獲得內(nèi)參基因及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,熒光定量的實驗數(shù)據(jù)采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量分析,計量數(shù)據(jù)資料均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示[17],使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析,用Turkey法進(jìn)行多重比較分析(P＜0.05為顯著水平)。

1.2.5 團(tuán)頭魴肝和鰓組織應(yīng)答氨氮脅迫后GST基因的表達(dá)分析

在氨氮脅迫后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h時,分別在處理組和對照組中隨機(jī)取3尾團(tuán)頭魴,取肝和鰓保存于-80℃冰箱用以提取RNA,再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板,進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System中進(jìn)行,對照組和處理組的團(tuán)頭魴肝和鰓組織cDNA樣品在每個時間點做3個熒光定量特異引物和內(nèi)參基因β-actin基因重復(fù)。

1.3 MaGST重組表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)所得到的MaGST的cDNA編碼區(qū)設(shè)計特異性引物“5′AAGATGGCAATGAAATTGGCATA 3′,含有NdeⅠ酶切位點”和“(5′AAATGGGGAAACAAGGAGTGAA 3′,含有XhoⅠ酶切位點和6×His純化標(biāo)簽”進(jìn)行GST體外重組表達(dá)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化后連入pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化Top10F’感受態(tài)細(xì)胞,通過特異性PCR進(jìn)行陽性克隆篩選。培養(yǎng)經(jīng)測序驗證后的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,純化后連接到pET21(a+)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌origami(DE3)感受態(tài)之后,菌液PCR驗證并測序。

1.4 MaGST重組蛋白純化、復(fù)性及活性檢測

在200 mL LB培養(yǎng)基(含100μg·mL-1氨芐青霉素)中接入5 mL含有重組質(zhì)粒的宿主菌origami (DE3),200 r·min-1,37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5～0.7時,加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng),分別在誘導(dǎo)2 h和4 h后各取2 mL菌液,SDS-PAGE電泳檢測。菌體加入20 mL緩沖液(50 mmol·L-1pH 7.4的PBS,含8 mol·L-1尿素),混勻,冰浴條件下超聲破碎至液體變澄清,然后4℃下10 000 g離心30 min,收集上清。上清經(jīng)過鎳瓊脂糖凝膠柱親和純化。純化后的重組蛋白,依次在含有6、4、2、1和0 mol·L-1尿素的50 mmol·L-1PBS(pH 7.4)中過夜透析(4℃),之后用不含尿素的50 mmol·L-1PBS(pH 7.4)連續(xù)透析2次。利用15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測透析后所獲得的純化樣品,采用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,蛋白濃度的測定參考Bradford(1976)的方法進(jìn)行[18]。在進(jìn)行測定時,以透析結(jié)束時的透析緩沖液代替待測蛋白作為對照。重組MaGST活性的測定采用南京建成的谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒,單位為U·mg-1蛋白。

圖1 團(tuán)頭魴GST基因cDNA全序列以及由此推測的氨基酸序列注:方框表示起始密碼子和終止密碼子,星號表示翻譯終止,大寫字母表示開放閱讀框,陰影部分表示Mu loop結(jié)構(gòu)域,方框表示GST基因N-terminal和C-terminal結(jié)構(gòu)域,下劃線表示PolyA加尾信號。Fig.1 cDNA sequence of GST gene and putative amino acid sequence inM.amblycephalaNote:The box respresents the initiation codon and stop codon,“*”means translation termination;the capital letter means ORF;the Mu loop domain was shaded in gray and N-terminal and C-terminal domain were boxed;the PolyA signal was marked by single underline.

1.5 鰓和肝臟組織光鏡樣品制備與觀察

氨氮脅迫實驗期間,分別于0 h和24 h采集樣品。每次從每個循環(huán)桶中隨機(jī)取出3尾進(jìn)行活體解剖,取各實驗組的肝和鰓經(jīng)生理鹽水漂洗后,用Bouin氏液固定,用常規(guī)梯度酒精逐級脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片機(jī)連續(xù)切片,厚度為5μm,蘇木精和伊紅染色,脫水封片,顯微觀察并拍照。

2 結(jié)果(Results)

表2 團(tuán)頭魴GST基因氨基酸序列與其他脊椎動物的相似性比較Table 2 The similarity between the GST amino acid sequence ofM.amblycephalaand other vertebrates

2.1 團(tuán)頭魴GST基因3’RACE和5’RACE擴(kuò)增、克隆及全長拼接

如圖1所示,利用Contig Express軟件對中間序列、5’端序列、3’端序列進(jìn)行拼接,得到團(tuán)頭魴GST基因全長1 011 bp的cDNA序列,其中有133 bp的5’末端非翻譯區(qū)(untranslated regions,UTR),224 bp的3’UTR,并且有明顯的AATAAA加尾信號和Poly(A)尾,654 bp的開放閱讀框(open reading frame, ORF),編碼218個氨基酸。團(tuán)頭魴GST主要有Mu loop(GEAPDYD),GST N-terminal和GST C-terminal三個結(jié)構(gòu)域。通過Compute pI/Mw程序預(yù)測該基因的蛋白分子量為25.95 kD,等電點(pI)為5.44。團(tuán)頭魴GST基因cDNA序列已提交到GenBank,登陸號為KM586249。

小鼠Mus musculus Mm Alpha1 AAH61134 Mm Alpha2 AAH30173 Mm Alpha3 AAH09805 Mm Alpha4 AAH12639 Mm Kappa1 NP-083831 Mm Mu4 AAH30444 Mm Mu6 AAH31818 Mm Pi AAH61109 Mm Theta1 AAH12254 Mm Theta2 Q61133 Mm Theta3 AAH03903 Mm mGST1 AAQ93322 Mm mGST2 NP-778160 Mm mGST3 AAH29669斑馬魚Danio rerio Dr Alpha AAH60914 Dr Kappa1 XP-686115 Dr Mu NP-997841 Dr Mu1 XP-690427 Dr Pi AAH83467 Dr Pi2 NP-001018349 Dr Theta NP-956878 Dr Theta3 XP-692427 Dr Rho CAK10882 Dr mGST1 AAH74022 Dr mGST2 XP-700815 Dr mGST3 XP-695658河豚Tetraodon nigroviridis PlRho CAA64493 PlRho CAA64496大口黑鱸Micropterus salmoides Ms Rho AAQ91198 Tn Alpha CAG09409 Tn Mu CAG07510 Tn Theta CAG09655 Tn mGST1 CAF97117 Tn mGST2 CAG04538 Tn mGST3 CAG09920鰈魚Pleuronectes platessa真鯛Pagrus major Pm Rho BAD98443鰷魚Pimephales promelas Pr Rho AAF78081鯽魚Carassius auratus Ca Pi ABF57553歐鰻Anguilla anguilla Aa Pi AAS01601團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala Ma Mu KM586249

圖2 團(tuán)頭魴mu型GST基因推導(dǎo)氨基酸序列的多序列比較注:Mu型GST基因結(jié)構(gòu)域用紅色方框框出；GSH結(jié)合位點用菱形標(biāo)出；底物結(jié)合位點用倒三角標(biāo)出；N端二聚體用圓形標(biāo)出,C端二聚體用箭頭標(biāo)出。Fig.2 Multiple sequence alignments of mu-MaGST with other five homologous mu-GST amino acid sequencesNote:The mu class GST motif is boxed in red.Diamond,GSH binding sites;Inverted triangle,substrate binding sites;Circular,dimer interface in N-terminal domain;and arrow,dimer interface in C-terminal domain.

圖3 利用MEGA4.0軟件構(gòu)建各物種GST基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GST amino acid sequence in diffrerent groups by MEGA 4.0

2.2 團(tuán)頭魴GST基因的同源性分析

氨基酸序列比對結(jié)果顯示團(tuán)頭魴GST的氨基酸序列與草魚GST同源性最高,相似度高達(dá)91%,運(yùn)用DNAMAN軟件將團(tuán)頭魴GST的氨基酸序列與其他已公布的6種魚類的氨基酸序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果如圖2所示,顯示該基因在魚類中的同源性較高,均有比較保守的3個酶催化位點以及底物結(jié)合位點。

2.3 團(tuán)頭魴GST基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

團(tuán)頭魴與其他脊椎動物的GST基因氨基酸序列的亞型與基因登錄號如表2所示,其他脊椎動物包括人、小鼠、斑馬魚、河豚、大口黑鱸、真鯛、鰷魚、鯽魚等。

用MAGE4.0軟件對已經(jīng)公布的序列以及團(tuán)頭魴的GST基因氨基酸序列采用鄰位相聯(lián)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3所示,團(tuán)頭魴GST基因與其他脊椎動物mu型GST基因親緣關(guān)系較近并處在同一分支,表明團(tuán)頭魴GST基因?qū)儆趍u型。魚類與哺乳動物GST親緣關(guān)系較遠(yuǎn),可能與魚類GST基因在水環(huán)境毒素去毒代謝中承擔(dān)的特殊功能有關(guān)。

2.4 團(tuán)頭魴GST基因的組織表達(dá)

以團(tuán)頭魴 β-actin為內(nèi)參基因采用熒光定量PCR檢測健康團(tuán)頭魴肌肉、鰓、腎、腦、肝、腸的這6個組織中GST基因的相對表達(dá)量,結(jié)果如圖4所示:該基因在肌肉、鰓、腎、腦、肝、腸道內(nèi)均有表達(dá),其中在肝和鰓組織中表達(dá)量較高,在腸道組織中表達(dá)量最低。

圖4 熒光定量PCR方法檢測團(tuán)頭魴各組織中GST mRNA的相對表達(dá)量Fig.4 GST mRNA expression in different tissues of M.amblycephalaby qRT-PCR

2.5 團(tuán)頭魴GST的mRNA在受到氨氮脅迫后不同時間點表達(dá)規(guī)律

采用熒光定量PCR方法檢測團(tuán)頭魴受到氨氮脅迫6、12、24、48 h后肝和鰓中GST的表達(dá)規(guī)律。肝組織和鰓組織的脅迫前后表達(dá)模式類似,如圖5所示,團(tuán)頭魴肝組織中的GST基因在氨氮脅迫的6～48h時,其表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05)；由圖6中可知,與對照組相比,團(tuán)頭魴鰓組織中的GST基因表達(dá)水平在脅迫6～48 h顯著上升(P＜0.05)。

圖5 氨氮脅迫后團(tuán)頭魴肝組織中GST基因mRNA的表達(dá)量變化注:*表示與對照組差異顯著(n=3,*P＜0.05)。Fig.5 Expression of GST in liver ofM.amblycephalaunder acute ammonia exposueNote:* means significant different compared with control(n=3,*P＜0.05).

圖6 氨氮脅迫后團(tuán)頭魴鰓組織中GST基因mRNA的表達(dá)量變化注:*表示與對照組差異顯著(n=3,*P＜0.05)。Fig.6 Expression of GST in gill ofM.amblycephalaunder acute ammonia exposueNote:* means significant different compared with control(n=3,*P＜0.05).

圖7 重組團(tuán)頭魴GST蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果注:M,標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker；1,未加IPTG的大腸桿菌培養(yǎng)物(對照)；2,添加IPTG誘導(dǎo)2 h；3,添加IPTG誘導(dǎo)4 h；4,純化后的團(tuán)頭魴GST重組蛋白。Fig.7 The SDS-PAGE result of recombinant MaGSTNote:Line M shows the protein marker;Lane 1,negative control for recombinant MaGST(without induction);lane 2,induced expression for 2 h of recombinant MaGST;lane 3,induced expression for 4 h of recombinant MaGST;lane 4,purified recombinant MaGST.

2.6 團(tuán)頭魴GST原核重組表達(dá)及活性測定

將團(tuán)頭魴GST的編碼區(qū)重組到pET21(a+)中,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用凝膠柱純化得到帶有6× His標(biāo)簽的團(tuán)頭魴GST蛋白。從圖7所示,所獲得的純化蛋白的分子量為26 kDa左右,與預(yù)測的分子量結(jié)果相吻合。經(jīng)GST檢測試劑盒測定,重組團(tuán)頭魴GST的GST活力為(10.36±0.68)U·mg-1蛋白。

2.7 氨氮脅迫導(dǎo)致鰓和肝臟組織病理變化

氨氮脅迫前,團(tuán)頭魴幼魚的鰓絲和鰓小片泌氯細(xì)胞較少,鰓絲排列整齊規(guī)則(圖8),而氨氮脅迫24 h時,泌氯細(xì)胞較少、鰓小片融合、變短,基部毛細(xì)血管破裂。氨氮脅迫前,團(tuán)頭魴幼魚的肝細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞輪廓清晰(圖8),而氨氮脅迫24 h時,肝細(xì)胞水樣變性嚴(yán)重,細(xì)胞溶解,輪廓模糊,血竇擴(kuò)張嚴(yán)重。

圖8 氨氮脅迫對團(tuán)頭魴幼魚鰓和肝臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響注:A表示氨氮脅迫0 h(對照組)鰓絲組織顯微結(jié)構(gòu)圖；B分別表示氨氮濃度(25mg·L-1)脅迫24 h鰓絲組織顯微結(jié)構(gòu)圖；C表示表示氨氮脅迫0 h(對照組)肝組織顯微結(jié)構(gòu)圖；D表示氨氮濃度(25mg·L-1)脅迫24 h肝組織顯微結(jié)構(gòu)圖。H.E染色(×200),標(biāo)尺50μm。CC,泌氯細(xì)胞；SL,鰓小片；LF,鰓小片融合；SSL,鰓小片變短；H,肝細(xì)胞；NH,細(xì)胞核腫大；DS,血竇擴(kuò)張。Fig.8 Effect of ammonia exposure on gill and liver microstructure in juvenileM.amblycephalaNote:A means the microscopical gill structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia at 0 h;B means the microscopical gill structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia(25mg·L-1)at 24 h;C means the microscopical liver structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia at 0 h;D means the microscopical liver structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia(25mg·L-1)at 24 h.H.E(×200), bar=50μm.CC,chloride cells;SL,secondary lamellae;LF,lamellar fusion;SSL,shortening of secondary lamellae;H,hepatocytes;NH,nuclear hypertrophy;DS,dilatation in sinusoids.

3 討論(Discussion)

GST基因是魚類重要的Ⅱ相去毒酶基因,其表達(dá)產(chǎn)物一方面緩解氧化壓力、抑制活性氧對機(jī)體的損傷,另一方面催化毒素形成親水化合物經(jīng)排泄系統(tǒng)排出體外[19]。GST基因亞型的分類基于對該基因N端結(jié)構(gòu)域的氨基酸、結(jié)構(gòu)、抗體反應(yīng)以及對抑制劑的敏感性[7]。本研究通過RACE PCR技術(shù)獲得了團(tuán)頭魴GST基因的cDNA序列,包含1個典型的GST-N結(jié)構(gòu)域和1個GST-C結(jié)構(gòu)域,其編碼的氨基酸序列與其他近源物種比對結(jié)果可判斷擴(kuò)增得到的cDNA序列屬于GST基因家族,同時與其他物種的Mu-型GST相比,具有一致的Mu-loop結(jié)構(gòu)域[20]。此外,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果也表明團(tuán)頭魴GST屬于mu型的1個成員,團(tuán)頭魴 GST與斑馬魚 mu型GST在系統(tǒng)樹上處于相鄰位置,且與其他魚類(河豚)聚成1簇,與團(tuán)頭魴分類學(xué)上的地位吻合。團(tuán)頭魴GST的組織定量表達(dá)分析顯示,該基因在各組織中均有表達(dá),但在肝組織中的表達(dá)量最高,然后依次是鰓、腎、肌肉、腦和腸道,這與已報到的鯉魚(Cyprinus carpio)GST基因的組織表達(dá)結(jié)果相一致[21]。

鰓和肝臟組織是魚類重要的呼吸和解毒器官,鑒于GST基因在團(tuán)頭魴肝臟和鰓組織表達(dá)量較高,本實驗選擇肝和鰓組織作為研究對象,在氨氮急性脅迫后不同時間段對團(tuán)頭魴肝和鰓組織中GST基因的定量表達(dá)分析顯示,肝和鰓組織中該基因的表達(dá)規(guī)律相似,表達(dá)水平均呈先升高后降低的趨勢,研究表明團(tuán)頭魴幼魚魚體處于在高濃度氨氮應(yīng)激初始狀態(tài)下防御與損傷或許處于平衡狀態(tài),隨著急性脅迫時間延長,平衡系統(tǒng)被打破組織發(fā)生損傷(肝和鰓組織結(jié)構(gòu)變化),機(jī)體抗氧化能力下降,這是因為GST的過氧化物酶活性能利用谷胱甘肽向氫過氧化物發(fā)動親核攻擊,使其還原為低毒的一元醇(monohydroxy alcohol),從而緩解氧化脅迫[22],而隨著氨氮脅迫時間的增加,過量的自由基和過氧化產(chǎn)物或許抑制了GST基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。最近在哺乳動物的研究中已經(jīng)證實氨中毒引發(fā)腦組織谷氨酰胺的積累進(jìn)一步導(dǎo)致其中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的氧化應(yīng)激并產(chǎn)生大量活性氧分子,這些活性氧分子不但直接對細(xì)胞造成損傷,還將通過引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用介導(dǎo)細(xì)胞膜的功能紊亂[23],而Hegazi等[24]在氨氮脅迫下的尼羅羅非魚肝臟和肌肉中也發(fā)現(xiàn)大量的活性氧自由基,抗氧化酶活性顯著升高,Sun等[25]也發(fā)現(xiàn)慢性氨氮脅迫下的鳙魚也存在類似的氧化應(yīng)激反應(yīng),這與本實驗室結(jié)果相吻合。為了進(jìn)一步確定氨氮脅迫是否產(chǎn)生一定程度氧化應(yīng)激損傷,本實驗選取GST表達(dá)量較高的時間點進(jìn)行鰓和肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察,氨氮脅迫24 h下團(tuán)頭魴幼魚鰓絲毛細(xì)血管擴(kuò)張,泌氯細(xì)胞增生,鰓小片卷曲,鰓小片融合、變短；而氨氮脅迫24 h下團(tuán)頭魴幼魚肝細(xì)胞腫大、細(xì)胞核變形溶解、血竇擴(kuò)張、細(xì)胞輪廓模糊,這與張武肖等[16]研究結(jié)果相一致。過量的自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物產(chǎn)生,丙二醛(MDA)被認(rèn)為是脂類過氧化損傷最具代表性的指標(biāo)[26],胡毅等[27]的研究表明青魚MDA含量隨著氨氮脅迫時間的延長而顯著增加,蔣玫等[28]的研究表明慢性氨氮脅迫對鯔魚MDA活性與氨氮濃度呈一定的正相關(guān)。故此,我們可推斷活性氧自由基與內(nèi)源性抗氧化能力的不平衡是導(dǎo)致氨氮毒性分子機(jī)制的主要原因之一。

鑒于mu型GST在細(xì)胞解毒和抗氧化防御中起著非常重要的作用[29]。本研究利用原核表達(dá)方法獲得了重組MaGST蛋白,其GST活力為(10.36± 0.68)U·mg-1蛋白,這與在真鯛(Pagrus major)GST重組蛋白活性相類似[30]。GST活力能反映機(jī)體抗氧化能力的高低,Lee等[31]通過原核表達(dá)的方法獲得了重組GST蛋白,其活性為天然GST的45%,故此本研究測定的重組MaGST蛋白的活力也可能只是其活性的部分。本研究純化的重組蛋白可用于制備MaGST的單克隆抗體,并用于GST相關(guān)表達(dá)的檢測,為團(tuán)頭魴mu-型GST功能的進(jìn)一步研究奠定了堅實基礎(chǔ),如何增強(qiáng)淡水魚類解毒酶基因的表達(dá)以減輕急性氨氮脅迫導(dǎo)致的致毒作用有待于進(jìn)一步研究。

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Molecular Cloning,Characterization and mRNA Expression of Mu-typ Glutathione S-Transferases from Megalobrama amblycephala

Sun Shengming1,Zhu Jian1,*,Ge Xianping1,Zhang Chengfeng1,Miao Linghong1,Zhang Wuxiao2, Zhang Qiong2
1.Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi 214081,China
2.Wuxi Fishery College,Nanjing Agricultural University,Wuxi 214081,China

9 March 2015 accepted 9 June 2015

Glutathione S-transferases(GSTs)play an important role in cellular detoxification and may have evolved in protecting cells against reactive oxygen metabolites.In this study,we report the molecular characterization of glutathione S-transferase(MaGST)from Bluntnose black breamMegalobrama amblycephala.The full-length cDNA of MaGST was 1 011 bp in length containing an open reading frame of 654 bp that encoded a 218-amino acid pu-tative protein.Its derived amino acid sequence was clustered with other vertebrate mu-type GSTs in a phylogenetic tree(NJ).Quantitative real-time RT-PCR analysis showed that mRNA expression of MaGST was detected in all tissues,including the brain,liver,muscles,gills,spleen,and intestines,with the highest level of expression in the liver and gill,the lowest expression in the muscles.Exposure to waterbrone ammonia significantly increased the mRNA expression of MaGST(P＜0.05)in liver and gill,respectively.Fish exposed to waterbrone ammonia also showed liver and gill tissue damage in 24 h.To further characterize the catalytic properties of this enzyme along with MaGST, we constructed the recombinant MaGST plasmid with a 6×His-Tag at the N-terminal of MaGST cDNA.Recombinant MaGST was highly expressed in transformedEscherichia coli,and its soluble fraction was purified by His-Tag affinity column chromatography.The GST activity of the recombinant MaGST was(10.36±0.68)U·mg-1protein.Overall,the results suggest a potential role for MaGST in detoxification and possibly conferring immune protection.

ammonia exposure;Megalobrama amblycephala;glutathione S-transferase;cloning

2015-03-09 錄用日期:2015-06-09

1673-5897(2016)1-295-11

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150309010

孫盛明,朱健,戈賢平,等.團(tuán)頭魴谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其在氨氮脅迫中的表達(dá)分析[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2016,11(1):295-305

Sun S M,Zhu J,Ge X P,et al.Molecular cloning,characterization and mRNA expression of mu-typ glutathione S-transferases fromMegalobrama amblycephala[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):295-305(in Chinese)

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金(2015C06XK01)；國家大宗淡水魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系華東養(yǎng)殖崗位(CARS-46-14)；十二五國家科技支撐計劃“長江下游池塘高效生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)集成與示范”(2012BAD25B07)

孫盛明(1983-),男,博士,助理研究員,研究方向為水生動物生理學(xué),E-mail:sunsm@ffrc.cn；

),E-mail:zhuj@ffrc.cn

簡介:朱健(1968—)，男，研究員，主要從事水產(chǎn)健康養(yǎng)殖研究。