古扎力努爾買提沙， 木塔力甫·艾買提， 艾爾肯·肉孜比拉力， 努爾滿古力·肉孜，

阿布力孜·阿布杜拉1, 2

?

·民族腫瘤學(xué)·

高良姜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡及基因表達(dá)的影響

古扎力努爾買提沙1， 木塔力甫·艾買提1， 艾爾肯·肉孜比拉力2， 努爾滿古力·肉孜3，

阿布力孜·阿布杜拉1, 2

(1新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011，

3新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科， 烏魯木齊 830000)

目的 探討高良姜素(Galangin)對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡及基因表達(dá)的影響。方法 從高良姜(Alpinia officinarum Hance) 中提取分離高良姜素，(1) 采用四甲基偶氮唑鹽 (MTT) 比色法，檢測空白對照組、不同濃度高良姜素干預(yù)組、順鉑 (Cisplatin) 組SiHa細(xì)胞在24、48、72 h內(nèi)的細(xì)胞存活率、用熒光倒置顯微鏡觀察對細(xì)胞形態(tài)的影響。 (2) 采用流式細(xì)胞檢測法檢測高良姜素在24 h內(nèi)對Siha細(xì)胞凋亡的影響。 (3) 采用熒光定量PCR的方法， 分析半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase 3)和CDK4等基因在高良姜素干預(yù)前、后的表達(dá)水平。 結(jié)果 以高良姜素干預(yù)宮頸癌SiHa細(xì)胞后，與空白對照組比較，細(xì)胞存活率明顯下降并呈劑量和時間依賴性；早期凋亡率明顯上升，并呈劑量依賴性；細(xì)胞凋亡因子Caspase 3上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，呈劑量依賴性，而高良姜素干預(yù)前、后細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4的表達(dá)調(diào)控?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 高良姜素能抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)理可能通過提高細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性，但對細(xì)胞周期的影響需要進(jìn)一步研究。

高良姜素； 宮頸癌Siha細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 基因表達(dá)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，僅次于乳腺癌[1-2]。新疆是我國宮頸癌高發(fā)區(qū)之一，在南疆地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌患病率和死亡率很高。SiHa細(xì)胞株是宮頸癌細(xì)胞株研究中應(yīng)用最廣泛的癌細(xì)胞。本課題組前期研究中，從高良姜提取高良姜總黃酮，并干預(yù)宮頸癌SiHa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)高良姜總黃酮 (TFs) 能誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平[3-4]。然而，高良姜總黃酮包括高良姜素、槲皮素、 槲皮素-3-甲醚、 山奈酚、山奈酚-4-甲醚、二氫高良姜醇和兒茶精等多種黃酮類化合物[5], 其抑制作用是上述黃酮類化合物共同發(fā)揮作用的結(jié)果，各有效成分的抗腫瘤活性和機(jī)理待進(jìn)一步研究。

高良姜素(Galangin, 3,5,7-三羥基黃酮)作為一種黃酮類化合物，可從姜科山姜屬植物高良姜的根莖、植物的地上部分中提取分離得到?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，高良姜素在抗誘變、抗畸變、抗腫瘤、抗氧化和清除自由基、調(diào)解代謝酶活性等方面發(fā)揮獨(dú)特的化學(xué)防護(hù)作用[6-8]。近年來，高良姜素的抗腫瘤活性越來越受到關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)高良姜素對CRT陽性細(xì)胞[9]、乳腺癌細(xì)胞株(Hs578T、U937[10-11]、人食管鱗癌細(xì)胞株(KYSE-510)[6]、肝細(xì)胞株[12-13]、TRAIL誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞[14]、HL-60[15]、人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (HNSCC)[16]、胃癌細(xì)胞 (SNU-484)[17]、結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-15、HT-29)[18]、腎癌細(xì)胞 (Caki-1、786-0)[19]等腫瘤細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用，而尚未有文獻(xiàn)報道高良姜素對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制相關(guān)的研究。

本研究首先從高良姜的根部提取高良姜總黃酮，再通過聚丙烯酰胺色譜柱分離方法，從總黃酮中分離高良姜素，進(jìn)而對宮頸癌SiHa細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)，采用MTT和流式細(xì)胞檢測技術(shù)，檢測細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡，評價高良姜素的抗宮頸癌SiHa 細(xì)胞活性。其次，采用RT-PCR法檢測不同濃度高良姜素處理后的細(xì)胞中關(guān)于細(xì)胞凋亡基因半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase 3)和CDK4表達(dá)水平的變化，探討高良姜素影響宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡和基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，為宮頸癌的臨床治療提供新的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS),雙抗(青霉素和鏈霉素)和胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT),二甲基亞砜(DMSO)和Annexin V-FITC等試劑均購自Gibco公司；Trizol試劑(DP405 北京天根生物公司)，順鉑(大連美侖)，氯仿(上海生工)，異丙醇、乙醇(上海生工)，聚酰胺(新疆恒博鑫業(yè))，cDNA 合成試劑盒(Fermentas)，SYBR Green1試劑盒(TAKARA)；宮頸癌SiHa細(xì)胞由新疆地方病分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph, 德國)，CO2孵育箱(HeraCell-150, Thermo Fishers公司)，生物安全柜(Thermo KS-18, Thermo Fishers公司)，酶標(biāo)儀(Beckmann Coulters 公司)，流式細(xì)胞儀(LSRⅡ, BD Biosciences公司)，光學(xué)顯微鏡(BA210, Motic公司)，定量PCR 儀(Bio-Rad, 美國)，核酸-蛋白快速測定儀。

1.2 高良姜素的制備 將前期研究中按照常規(guī)化學(xué)提取方法[20]提取的粗提物(高良姜總黃酮)用60 mL 95%乙醇溶解，慢慢注入到已活化的聚酰胺色譜柱，再用500 mL 95% 乙醇飽和，過夜；次日分別用3倍柱體積的水及20%、40%、50%、60% 的乙醇溶液洗脫；合并50% 和60% 的乙醇洗脫液，減壓濃縮成淡黃色混懸液，放置4℃ 冰箱，靜止分層；棄除上層，過濾下層，濾紙上的殘?jiān)脽o水乙醇收集到表面皿上，靜止自然揮發(fā)，得黃色粉末狀固體，即高良姜素。用DMSO溶解高良姜素，配置濃度為80 mg/mL的母液。

1.3 SiHa細(xì)胞的培養(yǎng) 在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，使用含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時，用胰蛋白酶 (0.25%) 消化方法收集細(xì)胞，用于MTT、流式細(xì)胞檢測等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的傳代和接種。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和MTT檢測 按 6×103個細(xì)胞/孔密度， 將宮頸癌 SiHa 細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)。24 h后，將96孔板細(xì)胞設(shè)為空白對照組、不同濃度高良姜素干預(yù)組、順鉑組3組，每個組6個復(fù)孔。配置空白對照組培養(yǎng)液(200 μL DMEM培養(yǎng)液加入1 μL DMSO，即DMSO濃度為0.5%)；配置高良姜素150、125、100、75、50、25 μg/mL組干預(yù)溶液：將80 mg/mL的母液以DMSO逐步稀釋至30、25、20、15、10、5 mg/mL的高良姜素溶液，再按照200 μL DMEM培養(yǎng)液加入1 μL藥物的比例，將不同濃度高良姜素溶液加入到DMEM培養(yǎng)液中，配置干預(yù)濃度為150、125、100、75、50、25 μg/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液；配置順鉑100、50、25 μg/mL組溶液：將25 mg/mL 順鉑母液以DMSO逐步稀釋至20、10、5 mg/mL濃度，再用DMEM培養(yǎng)液稀釋至100、50、25 μg/mL濃度，并按24、48、72 h 時間梯度對宮頸癌 SiHa 細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)。藥物干預(yù)結(jié)束后，在24、48、72 h時，使用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 繼而加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，孵育4 h后，棄去培養(yǎng)基，以 150 μL DMSO 溶解，在酶標(biāo)儀上 570 nm 處讀取吸光度并按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白對照組)/ OD空白對照組×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 在6 孔培養(yǎng)板上按1×105個細(xì)胞/孔密度培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行藥物干預(yù)；24 h后收集細(xì)胞 (約3×104個細(xì)胞)，依次加入400 μL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒提供的結(jié)合緩沖液 (1×binding buffer)、5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，在室溫下避光反應(yīng)15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 RT-PCR檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平 以25 μg/mL和100 μg/mL高良姜素干預(yù)細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，利用核酸-蛋白快速測定儀測定所提取RNA濃度和純度，用1% 瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。隨后抽取1 μg總RNA利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并按說明書合成cDNA；再以cDNA為模板， 并以β-actin為內(nèi)參照，相應(yīng)基因上下游引物(表1) 及SYBR對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)條件為：DNA變性 95℃ 3 min， 合成40個循環(huán) (95℃ 10 s，55℃～62.6℃ 30 s)。

表1 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 高良姜素對SiHa細(xì)胞形態(tài)的影響 在24 h，與空白對照組相比，隨著高良姜素和順鉑濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞胞體縮小，皺縮或碎裂，培養(yǎng)液中有較多的細(xì)胞碎片，懸浮細(xì)胞增多(圖1、2)；在觀察不同時間段細(xì)胞狀態(tài)時，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)后細(xì)胞增殖比正常細(xì)胞增殖緩慢(圖 3)。

空白對照組 高良姜素125 μg/mL組 高良姜素75 μg/mL組 高良姜素25 μg/mL組

圖1 高良姜素影響SiHa細(xì)胞形態(tài)的濃度依賴效應(yīng)(24 h, ×200)

2.2 高良姜素干預(yù)對SiHa宮頸癌細(xì)胞存活率的影響 與空白對照組比較，隨著藥物劑量增加和干預(yù)時間延長，SiHa細(xì)胞增殖活力(存活率)均梯度性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量和時間依賴性；與順鉑組(Cisplatin, DDP)相比較，其效應(yīng)基本相似(表2)。

空白對照組 順鉑100 μg/mL組 順鉑50 μg/mL組 順鉑25 μg/mL組

圖2 順鉑影響SiHa細(xì)胞形態(tài)的濃度依賴效應(yīng)(24 h, ×200)

空白對照組 (24 h) 空白對照組 (48 h) 空白對照組 (72 h)

高良姜素50 μg/mL 組 (24 h) 高良姜素50 μg/mL 組 (48 h) 高良姜素50 μg/mL 組 (72 h)

圖3 高良姜素(50 μg/mL)影響SiHa細(xì)胞形態(tài)的時間依賴效應(yīng)(×200)

組別細(xì)胞存活率24h48h72h空白對照組 100.00 100.00 100.00高良姜素25μg/mL組74.43±0.46*66.70±0.44*56.40±2.01*高良姜素50μg/mL組56.90±0.87*40.27±1.72*33.90±0.63*高良姜素75μg/mL組58.80±1.18*45.80±0.79*34.53±1.27*高良姜素100μg/mL組54.50±0.26*44.10±0.53*35.43±2.19*高良姜素125μg/mL組44.53±0.67*30.07±2.00*18.83±1.48*高良姜素150μg/mL組29.17±1.42*27.67±0.95*18.07±1.09*順鉑25μg/mL組64.67±1.9125.17±0.9816.07±0.29順鉑50μg/mL組47.10±0.9617.53±0.6713.07±0.38順鉑100μg/mL組40.13±0.2116.40±0.5313.13±0.32

注: 與空白對照組比較，*P<0.05。

2.3 高良姜素對SiHa宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 在空白對照組，SiHa細(xì)胞自然發(fā)生的早期和晚期凋亡指數(shù)分別為5.6% 和0.4%，以25、100 μg/mL 高良姜素干預(yù)24 h后，早期凋亡率分別為21.3%和87.7%，晚期凋亡率分別為0.7% 和8.5%；與空白對照組比較，早期凋亡率明顯上升，呈劑量依賴性。以25 μg/mL 順鉑干預(yù)24 h后發(fā)生的早期凋亡和晚期凋亡率分別為56.7% 和11.1 %(圖4)。

2.4 高良姜素干預(yù)對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較，25 μg/mL和100 μg/mL的高良姜素干預(yù)24 h 后，SiHa細(xì)胞內(nèi)Caspase 3基因的 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 高良姜素100 μg/mL組Caspase 3的表達(dá)水平高于高良姜素25 μg/mL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高良姜素干預(yù)后CDK4的表達(dá)水平上調(diào)，與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高良姜素25 μg/mL組及100 μg/mL 組CDK4 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表 3)。

3 討論

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制主要與病毒感染[21]、癌基因與抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、端粒與端粒酶等有關(guān)。其中，人乳頭狀瘤病毒(HPV)的單一或多重持續(xù)感染現(xiàn)已被公認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[22]。 95% 以上的宮頸癌是由高危型HPV 引起的，其中 HPV16與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，HPV18 則與宮頸腺癌相關(guān)[23]。近年來研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物在治療腫瘤、心血管疾病、糖尿病、炎癥、細(xì)菌、病毒感染(抗HIV病毒等)等多方面具有藥理作用，而上述作用歸因于其特有的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即黃酮結(jié)構(gòu)中一定數(shù)目的羥基(2～4個)、C環(huán)2、3位的雙鍵、2位的 β環(huán)定位、3位和6位的羥基、β環(huán)上鄰位的羥基是發(fā)揮抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)效應(yīng)元件。諸多研究表明，黃酮類化合物主要是通過阻滯癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制蛋白激酶活性、抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等機(jī)制發(fā)揮抗癌效應(yīng)[24]。本研究中使用的高良姜素是從中藥高良姜的根部提取純化的單體黃酮類化合物，其分子結(jié)構(gòu)中C環(huán)2、3位的有2個雙鍵，2位的 β環(huán)定位、3位有羥基(即β環(huán)上鄰位的羥基)，符合上述黃酮類化合物發(fā)揮抗腫瘤作用的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。本課題組在前期研究中，通過細(xì)胞水平研究， 發(fā)現(xiàn)高良姜總黃酮能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖， 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對高良姜總黃酮中高良姜素(單體)的抗癌活性進(jìn)行研究。本課組前期研究報道了以25～150 μg/mL濃度的高良姜總黃酮干預(yù)SiHa細(xì)胞后，其細(xì)胞存活率分別為86.26%、80.05%、60.29%、59.51%[3]。本研究中，在25～150 μg/mL濃度范圍的高良姜素干預(yù)后的細(xì)胞存活率均明顯低于高良姜總黃酮干預(yù)后的細(xì)胞細(xì)胞存活率。MTT和細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，高良姜素抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，呈劑量和時間依賴性。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述結(jié)構(gòu)分析可推測，高良姜素具有抗宮頸癌活性。

組別基因名稱Caspase3CDK4空白對照組0.34±0.040.36±0.04高良姜素25μg/mL組0.67±0.080.42±0.05高良姜素100μg/mL組1.18±0.270.54±0.10F值5.6021.984P值0.0030.137

空白對照組 高良姜素100 μg/mL組 高良姜素25 μg/mL組 順鉑25 μg/mL組

圖4 不同濃度高良姜素對SiHa細(xì)胞凋亡的影響(24 h)

Caspase是半胱氨酸依賴性細(xì)胞死亡蛋白酶，是一大類凋亡調(diào)節(jié)基因。Caspase 3是凋亡執(zhí)行因子，其能夠直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白而引起凋亡[25]。CDK 4 (cyclin D dependent kinase 4) 是一種細(xì)胞周期蛋白激酶，在p16 (INK4A)-CDK4/6-cyclin D1-pR-Rb-E2F信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中可與cyclin D1形成復(fù)合體， 抑制 pRB 活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化[26]。本研究采用RT-PCR方法，進(jìn)一步研究高良姜素促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，研究結(jié)果顯示，高良姜素通過提高凋亡執(zhí)行因子Caspase 3的轉(zhuǎn)錄水平、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白的降解，實(shí)現(xiàn)凋亡作用。因此，高良姜素可能是高良姜總黃酮中發(fā)揮主要作用的有效成分，這對基于高良姜素的抗腫瘤新藥研發(fā)有重要意義。

本研究中發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)后CDK4基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化，而在前期研究中，吾尼且木·吐拉克等[4]發(fā)現(xiàn)高良姜總黃酮干預(yù)宮頸癌Siha細(xì)胞使CDK4基因下調(diào)表達(dá)，說明高良姜總黃酮中可能有另外一種單體黃酮類藥物影響其表達(dá)水平，這部分內(nèi)容需要進(jìn)一步研究。另外，在以往研究中報道，干細(xì)胞標(biāo)記物是胚胎干細(xì)胞階段的轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤干細(xì)胞中過度表達(dá)，可能與腫瘤組織的形成、侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[27-29]。在今后的研究中進(jìn)一步探討良姜素與宮頸癌干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的相互作用機(jī)制，是新一代抗宮頸癌藥物研發(fā)的重要切入點(diǎn)。

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(本文編輯：楊晨晨)

The effects of Galangin against human cervical cancer apoptosis and gene expression levels in vitro

Guzhalinuermaitisha1, Mutalifu Aimaiti1, Aierken Rouzibilali2, Nuermanguli Rouzi3, Abulizi Abudula1, 2

(1KeyLaboratoryofMolecularBiologyandEndemicDiseases;2DepartmentofBiochemistry,CollegeofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China;3DepartmentofGynecology,People′sHospitalofXinjiangUyghurAutonomousRegion,Urumqi830000，China)

Objective To investigate effects of galangin isolated from Alpinia officinarum Hance on growth and apoptosis and related gene expressions in SiHa cervical carcinoma cells. Methods (1) Changes in cell viability after treatment of SiHa cervical carcinoma cells with different dose of galangin and Cisplatin at 24 h, 48 h and 72 h were measured by methylthiazolyl tetrazolium (MTT) and Changes in cell morphology were documented by inverted opticmicroscopy. (2) The 24 h apoptopic rate of SiHa cervical carcinoma cells induced by galangin were detected by FCM. (3) The expression of Caspase 3 and CDK 4 were analyzed by fluorescent quantitative PCR. Results After the treatment of SiHa cervical carcinoma cells with galangin, cell viability decreased significantly in a dose-and time-dependent manner. The early stage apoptosis rate increased than that in control with a dose-dependent manner. The expression of Caspase 3 in SiHa cervical carcinoma cells were significantly increased (P<0.05), while the expression of CDK 4 was no significant difference than that in control (P>0.05). Conclusion Galangin can inhibit proliferation and induce apoptosis of SiHa cervical carcinoma cells. However, its effect on the cell cycle arrest still remains to be further investigation.

Galangin; SiHa cervical carcinoma cells; Cell apoptosis; Gene expression

國家自然科學(xué)基金(81360321)

古扎力努爾買提沙(1983-)，女(維吾爾族)，在讀博士，助理研究員，研究方向：宮頸癌發(fā)病機(jī)制及早期預(yù)警。

阿布力孜·阿布杜拉，男(維吾爾族)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子生物學(xué)， E-mail: abulizi_a@126.com。

R737.33

A

1009-5551(2016)12-1595-06

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.12.028

2016-07-05]