肖 莉 陳 靖 盛崴宣 馮 楓 陳立芳

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038)

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氯胺酮誘導(dǎo)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制

肖 莉 陳 靖 盛崴宣 馮 楓 陳立芳

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038)

目的 探究氯胺酮誘導(dǎo)腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制。方法 分別用30、60、80、100 mg/ml氯胺酮分別處理小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞6、12、18、24 h，采用MTT法檢測(cè)氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率；用100 mg/ml氯胺酮不用時(shí)間處理小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)處理前后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率的變化；將不同處理后的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，Western印跡法檢測(cè)GSK-3β蛋白的表達(dá)；用100 mg/ml氯胺酮處理后的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞18 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。結(jié)果 30 mg/ml的氯胺酮處理6 h，細(xì)胞的凋亡率僅為(12.4±2.47)%，對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸增加；100 mg/ml氯胺酮處理24 h時(shí)小鼠神經(jīng)細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大值為(58.7±5.86)%。100 mg/ml的氯胺酮不用時(shí)間處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞后LDH釋放率與氯胺酮作用時(shí)間呈正相關(guān)，其中18 h釋放率較大，24 h皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放率為(192±4.39)%，在6～24 h達(dá)到最大，約為6 h處理的1.8倍。6 h GSK-3β蛋白表達(dá)量升高，約為對(duì)照組的(105.4±4.13)%，12 h的GSK-3β蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)較低水平為(118.7±3.56)%，18 h表達(dá)量明顯升高為(144.7±3.72)%，24 h為對(duì)照組的(197.3±4.36)%。與對(duì)照組相比，氯胺酮處理后的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)了大量的凋亡。結(jié)論 高劑量氯胺酮能夠誘發(fā)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能與GSK-3β蛋白激活相關(guān)。

氯胺酮；皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞；GSK-3β

全身麻醉是現(xiàn)代手術(shù)治療的輔助手段，可以減輕患者對(duì)手術(shù)的恐懼和痛苦〔1〕，但長(zhǎng)期使用麻醉會(huì)對(duì)人的大腦神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響〔2〕。氯胺酮作為臨床上經(jīng)常使用的麻醉劑，鎮(zhèn)痛效果極佳，體外組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明長(zhǎng)期使用氯胺酮會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重者導(dǎo)致神經(jīng)衰退〔3〕。本文研究氯胺酮作用于皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞后對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)及GSK-3β表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試劑 體重約80 g的小鼠，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。B27培養(yǎng)基、DEME、雙抗、FBS，美國(guó)Gibco公司；胰酶、DMSO、Annexin-FITC、Propidiuym Iodide，Sigma公司；MTT，上海譜振生物科技有限公司；pierce-膜蛋白提取試劑盒，上海偉進(jìn)生物科技有限公司；GSK-3β抗體，CST公司；LDH檢測(cè)試劑盒，碧云天生化科技有限公司；羊抗兔抗體，北京諾博萊德科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng) 在超凈臺(tái)將小鼠的頭部用酒精消毒后，有手術(shù)刀切斷小鼠頭部，用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)小鼠頭部，小心取出小鼠的腦部，置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，去除表面血管，將皮質(zhì)部分用剪刀剪成塊狀，加入0.25%的胰液中，37℃溫育10 min，反應(yīng)終止后，將懸浮液800 r/min離心5 min，棄去上清，加入DEME培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄去上清后加入DEME培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞37℃ 5%CO2，培養(yǎng)1 d后，離心后棄去上清培養(yǎng)液加入B27培養(yǎng)基，每2 d更換1次培養(yǎng)液，第6天時(shí)加入藥物進(jìn)行處理。

1.2.2 MTT法檢測(cè)氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率 在已經(jīng)培養(yǎng)6 d的細(xì)胞中加入氯胺酮進(jìn)行處理小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，藥物濃度30、60、80、100 mg/ml，分別處理6、12、18、24 h。對(duì)照組為不加氯胺酮的神經(jīng)細(xì)胞加入PBS溶液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入20 μl MTT，室溫下反應(yīng)4 h后，800 r/min離心3 min，棄去上清，加入200 μl DMSO，室溫反應(yīng)10 min，540 nm下進(jìn)行OD值測(cè)定，公式：凋亡率=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%。

1.2.3 氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率 采用LDH試劑盒進(jìn)行測(cè)定，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入50 μl LDH底物，50 μl 不同處理的細(xì)胞上清液，黑暗下反應(yīng)30 min，490 nm下測(cè)定吸光值為細(xì)胞上清中LDH釋放量。向原96孔板內(nèi)加入溶解酶，37℃反應(yīng)1 h，取50 μl 細(xì)胞反應(yīng)液，加入50 μl LDH底物，避光反應(yīng)30 min后，490 nm測(cè)定吸光值為神經(jīng)細(xì)胞總LDH釋放量，細(xì)胞LDH釋放率=OD上清/OD總。

1.2.4 Western印跡法檢測(cè)GSK-3β蛋白的表達(dá) 將不同處理后的神經(jīng)細(xì)胞離心后收集，參照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取蛋白，在蛋白核酸分析儀上測(cè)定提取蛋白的濃度，取同等蛋白量20 μg，加入上樣緩沖液100℃變性失活，配制10%分離膠、4%濃縮膠，樣品進(jìn)入濃縮膠電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后調(diào)電壓140 V，電泳結(jié)束后，將蛋白凝膠在NC膜 4℃進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，過(guò)夜反應(yīng)后，加入脫脂牛奶4℃下封閉，取出PVDF膜，PBS 溶液清洗后加入一抗鼠抗GSK-3β，4℃孵育過(guò)夜，加入Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗3次，每次約10 min，加入稀釋后的標(biāo)記羊抗兔抗體室溫下反應(yīng)1 h，加入TBST清洗3次，每次約10 min。將PVDF膜放入凝膠成像儀中，保存圖片。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)氯胺酮處理后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡 將用100 mg/ml氯胺酮處理后的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞18 h，對(duì)照組細(xì)胞加入DMSO溶液，反應(yīng)結(jié)束后用PBS溶液清洗細(xì)胞，800 r/min離心后細(xì)胞沉淀，加入Annexin-FITC和Propidiuym Iodide混勻，避光培養(yǎng)15 min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)，Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法測(cè)定氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率 30 mg/ml的氯胺酮處理6 h，細(xì)胞的凋亡率僅為(12.4±2.47)%，對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸增加，60 mg/ml組處理后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率高于30 mg/ml；當(dāng)氯胺酮濃度為100 mg/ml、處理時(shí)間為24 h，小鼠神經(jīng)細(xì)胞的抑制率達(dá)到最大值為(58.7±5.86)%，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率與氯胺酮的作用時(shí)間、濃度呈依賴關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率

與30 mg/ml組相比:1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率 未經(jīng)氯胺酮處理的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放率為100%，并且不隨作用時(shí)間的變化而變化。與對(duì)照組相比，氯胺酮作用后的神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率升高，與氯胺酮作用時(shí)間呈正相關(guān)，6 h皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率為(115±5.27)%,18 h釋放率變化較大為(121±4.26)%，此時(shí)氯胺酮開(kāi)始高效發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，18 h LDH釋放率為(160±5.28)%；24 h LDH釋放率為(192±4.39)%。

2.3 Western印跡法檢測(cè)GSK-3β蛋白的表達(dá) 6 h組與對(duì)照組相比GSK-3β蛋白表達(dá)量升高，約為對(duì)照組的(105.4±4.13)%，12 h的GSK-3β蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)較低水平為(118.7±3.56)%，18 h表達(dá)量明顯升高為(144.7±3.72)%，24 h為(197.3±4.36)%，加入氯胺酮處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞6～24 h內(nèi)，GSK-3β蛋白活性被激活。見(jiàn)圖1。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)氯胺酮處理后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡 與對(duì)照組未經(jīng)氯胺酮處理的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞相比，處理后的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)了大量的凋亡，表明氯胺酮能夠誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖2。

圖1 氯胺酮不同時(shí)間處理后GSK-3β蛋白表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)氯胺酮處理后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡

3 討 論

氯胺酮是臨床上經(jīng)常使用的全身麻醉劑，它能夠使交感神經(jīng)保持正常的功能，對(duì)循環(huán)、呼吸系統(tǒng)也有一定的保護(hù)作用，其主要作用機(jī)制是通過(guò)抑制神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及其與NMDA受體作用，從而發(fā)揮全身麻醉的效果〔4〕。有研究表明大劑量使用氯胺酮能夠使小鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，嚴(yán)重影響后天的認(rèn)知學(xué)習(xí)功能〔5〕。機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的凋亡屬于維持機(jī)體平衡，但是神經(jīng)系統(tǒng)的病變則會(huì)加速神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔6〕。本研究選取了氯胺酮的4個(gè)濃度30、60、80、100 mg/ml，結(jié)果顯示氯胺酮對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)加速，細(xì)胞的凋亡率升高。氯胺酮的濃度為80 mg/ml時(shí)，細(xì)胞的染色體已經(jīng)嚴(yán)重變形〔7〕，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)出生1 w左右的大鼠加大了藥物濃度，結(jié)果表明在100 mg/ml氯胺酮小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率高于80 mg/ml。高濃度的氯胺酮能夠嚴(yán)重影響小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

LDH是機(jī)體糖酵解過(guò)程中的一種酶，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)參與正常的生理代謝，組織發(fā)生病變或者遭到破壞時(shí)細(xì)胞內(nèi)的LDH滲出，導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)中LDH含量升高，因此LDH是檢測(cè)機(jī)體代謝的最敏感的指標(biāo)〔8〕。本文結(jié)果顯示，氯胺酮處理后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放率升高，18 h氯胺酮開(kāi)始高效發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，24 h皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的LDH釋放率達(dá)到最大。

GSK-3β是廣泛分布在腦組織中的一類絲氨酸類蛋白激酶，參與神經(jīng)傳遞過(guò)程中的信號(hào)傳遞〔9〕。研究表明GSK-3β蛋白參與神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，關(guān)于GSK-3β參與大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的報(bào)道較少，神經(jīng)細(xì)胞受損后GSK-3β蛋白結(jié)構(gòu)中的Ser9發(fā)生去磷酸化，GSK-3β被激活進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)中其他相關(guān)應(yīng)答基因的表達(dá)〔10〕。倪錦〔11〕研究表明氯胺酮能夠誘導(dǎo)乳鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)激活GSK-3β活性發(fā)揮作用〔11〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入氯胺酮處理皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞6～24 h，GSK-3β蛋白活性被激活。

高劑量氯胺酮能夠?qū)е掠资竽X細(xì)胞的凋亡，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持正常生理活動(dòng)的正?，F(xiàn)象，但受損或病變的神經(jīng)細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)異常凋亡，進(jìn)而影響腦部神經(jīng)的正常生理功能〔12〕。本研究中100 mg/ml氯胺酮作用小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞24 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果表明處理后的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，這一結(jié)果與之前測(cè)定的細(xì)胞凋亡率升高相符合，表明氯胺酮能夠誘導(dǎo)腦細(xì)胞大量凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明高劑量氯胺酮能夠促使腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并且激活GSK-3β活性，從而使腦部神經(jīng)系統(tǒng)功能受損。

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〔2015-11-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

肖 莉(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事麻醉方面研究。

R285

A

1005-9202(2016)21-5264-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.022