趙 騰 丁 穎 王 超 周春奎

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部，吉林 長春 130031)

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慢性缺血致血管性認(rèn)知障礙大鼠腦白質(zhì)病變與Ephrin-B3的相關(guān)性

趙 騰 丁 穎 王 超 周春奎

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部，吉林 長春 130031)

目的 探討Ephrin-B3是否參與了慢性腦缺血大鼠的腦白質(zhì)損害及認(rèn)知功能障礙。方法 選用 Wistar 大鼠48只，隨機(jī)分為假手術(shù)1組、假手術(shù)2組、模型30 d組、模型60 d組。模型組組應(yīng)用大鼠雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎法(2VO)制備慢性前腦缺血致血管性癡呆動物模型，假手術(shù)組僅有手術(shù)過程而未行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎。術(shù)后30 d，采用Morris水迷宮對假手術(shù)1組及模型30 d組大鼠于手術(shù)前及手術(shù)后的逃避潛伏期時間進(jìn)行檢測，比較手術(shù)前后及各組間的差異。而后將2組大鼠斷頭取腦。部分行HE染色，部分腦組織制成勻漿，行ELISA 檢測，統(tǒng)量各組Ephrin-B3的表達(dá)。術(shù)后60 d，按照上述同樣的方法對假手術(shù)2組及模型2組大鼠進(jìn)行處理。結(jié)果 造模后30 d，模型1組大鼠水迷宮的逃避潛伏期時間與假手術(shù)1組相比差異顯著(P<0.05)；造模后60 d，模型2組大鼠水迷宮的逃避潛伏期時間與假手術(shù)2組相比差異顯著(P<0.05)，說明模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均明顯降低。經(jīng)HE染色，發(fā)現(xiàn)缺血30 d及60 d組大鼠胼胝質(zhì)部位出現(xiàn)明顯白質(zhì)疏松、細(xì)胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)空泡樣改變。經(jīng)ELISA檢測，假手術(shù)1組、模型30 d組、假手術(shù)2組、模型60 d組大鼠腦內(nèi)Ephrin-B3濃度分別為(11.76±1.26)ng/ml、(12.08±1.32)ng/ml、(37.25±5.32)ng/ml、(48.65±6.88)ng/ml。模型30 d組與假手術(shù)1組Ephrin-B3表達(dá)量相比差異顯著(P<0.05)；模型2組與假手術(shù)2組相比差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 Ephrin-B3可能參與了慢性缺血致血管性癡呆大鼠的腦白質(zhì)損害及認(rèn)知功能障礙。

血管性癡呆；腦白質(zhì)病變；Ephrin-B3

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是指由腦血管疾病引起的腦損害所致的認(rèn)知障礙，慢性腦缺血是最常見的原因之一。VCI患者認(rèn)知損害的特征主要為執(zhí)行功能損害，也可以表現(xiàn)為記憶力損害〔1〕。目前研究認(rèn)為記憶力障礙主要與海馬功能損害有關(guān)，而執(zhí)行功能障礙主要與皮層下白質(zhì)損害有關(guān)〔2〕。腦白質(zhì)病變是VCI的主要病理變化，包括髓鞘脫失、軸突變性及神經(jīng)纖維斷裂。Ephrin-B3主要為少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種髓鞘生長相關(guān)抑制因子(MAIFs)，在髓鞘損傷后修復(fù)及抑制軸突再生的過程中起到關(guān)鍵作用。慢性腦缺血后腦白質(zhì)出現(xiàn)的一系列病理變化可能伴隨著Ephrin-B3的表達(dá)變化。本研究探討Ephrin-B3是否參與了慢性缺血后VCI的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取雄性Wistar大鼠48只，250～300 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供及喂養(yǎng)，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(吉)2014-0006，實驗動物使用許可證：SYXK(吉)2014-0018，實驗在吉林大學(xué)基礎(chǔ)實驗室進(jìn)行。

1.2 實驗動物分組及模型制備 48只Wistar大鼠在分組前都要進(jìn)行Morris 水迷宮實驗篩選，統(tǒng)計大鼠的訓(xùn)練成績，淘汰游泳能力差或智力低下的大鼠。按隨機(jī)數(shù)字表法分為缺血模型組和假手術(shù)組，每組24只。缺血模型組在手術(shù)后又分為 30 d、60 d亞組，每組12 只(6只用于HE染色；6只用于ELISA)。術(shù)后死亡的大鼠被剔除，并隨時補(bǔ)足相應(yīng)數(shù)目的動物。大鼠稱重，10%水合氯醛300 mg采用雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎方法(2OV)制備慢性腦缺血動物模型。

1.3 水迷宮檢測及樣本制備 造模后30 d，對各組大鼠進(jìn)行水迷宮試驗，4次/d，2 min/次，共5 d，記錄其逃避潛伏期。而后對假手術(shù)組隨機(jī)抽取12只及12只30 d缺血模型組大鼠用 10%水合氯醛麻醉，之后在冰盤上快速斷頭取腦。各組隨機(jī)抽取6只，用4%多聚甲醛后固定16 h，30%蔗糖溶液浸泡至標(biāo)本下沉，錫箔紙包裹，-70℃冰箱保存，-20℃恒冷切片機(jī)上連續(xù)冠狀切片，片厚20 μm，制成冰凍切片。采用石蠟包埋的方法制備石蠟切片。各組剩余6只將取出腦組織置于玻璃勻漿器中研磨，2 000 r/min離心15 min，留取上清。無菌條件下過濾，-80℃保存?zhèn)溆?。造模?0 d，按照同樣方法將假手術(shù)組剩余12只及60 d 缺血模型組大鼠斷頭取腦，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及提取腦勻漿上清。

1.4 Ephrin-B3的檢測方法 標(biāo)準(zhǔn)品按以下濃度備比稀釋48、24、12、6、3、1.5 ng/ml。大鼠Ephrin-B3抗體，產(chǎn)地：上海，規(guī)格1.0 g。設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及樣品孔。將稀釋后的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中，在樣本孔內(nèi)先加入10 μl待測樣本，然后用稀釋液稀釋5倍，空白孔不加。在各樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品中每孔均加入100 μl辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，封板膜密封，37℃水浴60 min。棄去液體后拍干，加洗滌液300 μl/孔，靜置1 min后拍干，如此重復(fù)5次，然后拍干。分別加入底物A和底物B 50 μl/孔，37℃避光孵育15 min。取出酶標(biāo)板，加終止液終止反應(yīng)50 μl/孔。以空白孔調(diào)零，在450 nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值)。終止后15 min內(nèi)檢測完成，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品的OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的公式計算出Ephrin-B3的濃度值即可。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮結(jié)果 見表1，表2。

2.2 胼胝體HE染色 在假手術(shù)組大鼠的胼胝體并未發(fā)現(xiàn)白質(zhì)疏松，細(xì)胞沿軸突較規(guī)則地排列，纖維排列相對整齊。而在缺血模型組大鼠胼胝體中可觀察到不同程度的腦白質(zhì)疏松，纖維排列凌亂，細(xì)胞數(shù)量減少，可見空泡樣改變，隨著缺血時間的延長，上述改變逐漸加重。見圖1。

表1 造模前水迷宮逃避潛伏期時間比較

表2 造模后水迷宮逃避潛伏期時間比較

圖1 各組大鼠胼胝體HE染色(×40)

2.3 Ephrin-B3檢測結(jié)果 Ephrin-B3水平假手術(shù)1組為(11.76±1.26)ng/ml；假手術(shù)2組為(12.08±1.32)ng/ml；30 d組為(37.25±5.32)ng/ml；60 d組為(48.65±6.88)ng/ml。30 d組及60 d組分別與假手術(shù)組相比，差異顯著(t=6.125、7.286，P<0.05)；而60 d組與30 d組相比也有顯著差異(t=1.89，P<0.05)。

3 討 論

執(zhí)行功能障礙突出被認(rèn)為是VCI區(qū)別于其他類型認(rèn)知障礙的特點之一，而執(zhí)行功能障礙主要與皮層和皮層下結(jié)構(gòu)聯(lián)系功能障礙有關(guān)〔2〕，因此認(rèn)為，皮層下白質(zhì)損害與VCI關(guān)系密切。

有研究顯示慢性缺血是導(dǎo)致VCI的常見原因之一，慢性腦缺血的組織病理學(xué)改變包括皮質(zhì)及海馬萎縮及神經(jīng)元變性、腦白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細(xì)胞增生和毛細(xì)血管床減少等〔3〕。而腦白質(zhì)疏松的主要表現(xiàn)是少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的髓鞘脫失以及軸突變性，從而導(dǎo)致神經(jīng)纖維脫失。既往大量研究顯示通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞存活可以使損傷或脫失的髓鞘得到修復(fù)，而軸突一旦損傷后其修復(fù)及再生則非常困難。其原因并非軸突不可再生，而是由軸突周圍的少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓鞘內(nèi)存在抑制軸突再生的眾多因子，即MAIFs，主要包括Nogo蛋白、OMgP蛋白、MAG蛋白及后期發(fā)現(xiàn)的Ephrin蛋白，其中Ephrin-B3被認(rèn)為是作用更為明顯的軸突生長抑制因子〔4，5〕。Ephrin-B3是促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞受體(Eph)家族成員之一，在正常生理狀況下處于低表達(dá)水平，但當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)損傷時，在相應(yīng)突觸及少突膠質(zhì)細(xì)胞中即可大量表達(dá)，其主要功能為維護(hù)髓鞘的完整及抑制軸突的再生。目前Ephrin-B3與脊髓損傷后的修復(fù)的相關(guān)性研究較為集中〔6〕，其與VCI的相關(guān)性研究國內(nèi)外尚未見報道。但從VCI的病理學(xué)變化來看，Ephrin-B3可能通對缺血后損傷的白質(zhì)內(nèi)軸突的再生產(chǎn)生抑制，從而加重認(rèn)知功能的損害。本研究結(jié)果證明Ephrin-B3參與了慢性缺血所致的腦白質(zhì)損傷，進(jìn)而引起認(rèn)知功能障礙。

1 Lopez-Valdes HE，Clarkson AN，Ao Y，etal.Memantine enhances recovery from stroke〔J〕.Stroke，2014；45(7)：2093-100.

2 Bird CM，Burgess N.The hippocampus and memory：insights from spatial processing〔J〕.Nat Rev Neurosci，2008；9(3)：182-94.

3 Lee JH，Parka SY，Shin YW，etal.Concurrent administration of cilostazol with donepezil effectively improves cognitive dysfunction with increased neuroprotection after chronic cerebral hypoperfusion in rats〔J〕.Brainres，2007；1185(4)：246-155.

4 Harvey PA，Lee DH，Qian F，etal.Blockade of Nogo receptor ligands promotes functional regeneration of sensory axons after dorsal root crush〔J〕.J Neurosci，2009；29(19)：6285-95.

5 Benson MD，Romero MI，Lush ME，etal.Ephrin-B3 is a myelin-based inhibitor of neurite outgrowth〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2005；102(30)：10694-9.

6 Qu Y，Zhao J，Wang Y，etal.Silencing ephrinB3 improves functional recovery following spinal cord injury〔J〕.Mol Med Rep，2014；9(5)：1761-6.

〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部專項基金(A03)

周春奎(1962-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病與癡呆的研究

趙 騰(1985-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病與癡呆的研究。

R743

A

1005-9202(2016)21-5245-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.013