張 麗 高 山 曲紅玉 李愛歆 郭 麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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白藜蘆醇對同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的Akt通路和小窩蛋白的影響

張 麗 高 山 曲紅玉 李愛歆 郭 麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的 探討Akt通路和小窩蛋白-1(Cav-1)在白藜蘆醇(Res)抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)模型動脈粥樣硬化(AS)過程中的作用。方法 利用同型半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，測定Res對于Akt蛋白表達(dá)的影響。通過哌立福新抑制Akt蛋白表達(dá)后，觀察Res對一氧化氮(NO)系統(tǒng)及Cav-1表達(dá)的作用。進(jìn)一步利用siRNA抑制Cav-1的表達(dá)后，進(jìn)一步研究Res對NO系統(tǒng)的影響。結(jié)果 (1)白藜蘆醇可抑制Akt蛋白的表達(dá)；(2)在抑制Akt蛋白表達(dá)后，NO系統(tǒng)表達(dá)明顯升高，且與Res濃度呈正相關(guān)，而Cav-1表達(dá)無明顯變化，但在加入Res后Cav-1表達(dá)明顯下降；(3)siRNA沉默Cav-1后，NO系統(tǒng)表達(dá)明顯升高，且與Res無濃度依賴性。結(jié)論 Res通過抑制Cav-1的表達(dá)，抑制Akt活性，促進(jìn)NO系統(tǒng)的作用，改善AS。

白藜蘆醇；Akt蛋白；小窩蛋白-1；一氧化氮

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)，而平滑肌細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及其產(chǎn)生的一氧化氮(NO)可與過氧負(fù)離子反應(yīng)形成過氧化亞硝酸鹽，引起組織損傷，促進(jìn)AS的惡化〔1，2〕。小窩蛋白(Cav)-1作為PI3k/Akt上游的靶點(diǎn)，是研究小窩結(jié)構(gòu)和功能的標(biāo)志蛋白，Cav-1的表達(dá)與AS的發(fā)病程度有密切聯(lián)系〔3〕。白藜蘆醇(Res)作為一種活性氧(ROS)清除劑，可有效抑制ROS的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗炎作用。因此，Res是一種潛在的抗AS的有效成分。本研究擬探討Res在PI3k/Akt途徑中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌操作取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康孕婦新生兒臍帶10～15 cm，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡，4℃保存，4 h內(nèi)使用。采用胰蛋白酶灌注法分離臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，接種至含25%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，隔日換液除去未貼壁細(xì)胞，每3～4 d傳代一次，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.2 模型細(xì)胞的制備及處理 將生長狀態(tài)良好的第2代或第3代細(xì)胞用于試驗(yàn)。將HUVEC按2×104個/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%的融合度開始試驗(yàn)，試驗(yàn)前采用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步化并過夜。培養(yǎng)細(xì)胞分為空白對照組(NC組，用PBS處理細(xì)胞)，同型半胱氨酸(Hcy)內(nèi)皮細(xì)胞損傷組(Hcy組)，Cav-1 siRNA的內(nèi)皮損傷組(Hcy+siRNA組)，不同濃度Res的內(nèi)皮損傷組(Hcy+Res組)以及Cav-1沉默后的不同濃度Res的內(nèi)皮損傷組(siRNA+Res)。除空白對照組外，其余各組均加入1 mmol/L的Hcy進(jìn)行內(nèi)皮損傷模型的構(gòu)建，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.3 NO濃度的測定 按照硝酸還原酶試劑盒說明書，測定不同組別的細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO濃度。

1.4 RT-PCR方法檢測eNOS和Cav-1 mRNA的表達(dá) 按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行。提取各組細(xì)胞中的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄cDNA。取2 μl cDNA進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為25 μl。eNOS上游引物5′-ACCCTAGAATGGAGAGCAT-3′，下游引物5′-GCCTGCACTGTCTGTGCCA-3′，Cav-1上游引物5′-CCTCTACAAGCTCAACAACATG-3′，下游引物5′-CACATCTTCAGAGTCAATCTGG-3′，內(nèi)參β-actin上游引物5′-AGCGACACAGTGCTGGAC-3′，下游引物5′-ACAAGCAATGATCTTGATGAC-3′ 。

1.5 Western印跡法檢測Akt、eNOS和Cav-1蛋白的表達(dá) 用10 μmol/L的Akt抑制劑哌立福新處理細(xì)胞12 h，測定上清液中的蛋白含量。將30 μg蛋白上樣于10%～12% Bis-Tris膠，電泳后轉(zhuǎn)膜。封閉1 h，然后用相應(yīng)特異性一抗(Akt抗體、p-Akt抗體、eNOS抗體、Cav-1抗體和β-actin 單克隆抗體)，分別在室溫下處理1 h。最后，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影。采用Image Lab軟件分析蛋白條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料組間比較用單因素方差分析，q檢驗(yàn)作兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1 Res對Akt蛋白表達(dá)的影響 Hcy組的Akt蛋白表達(dá)顯著升高。加入Res后，Akt蛋白表達(dá)下調(diào)。加入不同濃度的Res，各組Akt表達(dá)均小于Hcy組(P<0.01)。其中0.1 μmol/L的Res下調(diào)作用最明顯。隨著Res給藥濃度的增加，Akt蛋白表達(dá)逐漸降低。見圖1。

2.2 抑制Akt蛋白表達(dá)后Res對NO系統(tǒng)及Cav-1的影響 Hcy組的eNOS表達(dá)及NO濃度明顯降低，給予Akt抑制劑哌立福新后eNOS表達(dá)及NO濃度升高。加入不同濃度Res后，eNOS表達(dá)及NO濃度進(jìn)一步升高。Cav-1表達(dá)在給予哌立福新后并無明顯變化；給予不同濃度Res后，Cav-1的表達(dá)逐漸下調(diào)。見圖2，表1。

0：NC組；1：Hcy組；2～4：Hcy+Res組(0.1、1、10 μmol/L)圖1 Res對Akt蛋白表達(dá)的影響

0：NC組；1：Hcy組；2：哌立福新組；3～5：Hcy+Res組(0.1、1、10 μmol/L)圖2 抑制Akt蛋白表達(dá)后Res對eNOS、Cav-1表達(dá)的影響

組別eNOSmRNACav-1mRNANO(μmol/L)NC組1±0.081±0.12126.87±18.76Hcy組0.39±0.131)2.35±0.331)68±14.321)哌立福新組(10μmol/L)0.57±0.111)1.78±0.211)2)88.23±15.321)Hcy+Res(0.1μmol/L)組0.68±0.071)2)1.56±0.331)2)105.56±9.872)Hcy+Res(1μmol/L)組0.75±0.211)2)1.45±0.121)2)113±23.232)Hcy+Res(10μmol/L)組0.87±0.162)1.39±0.152)115±13.682)

與NC組比較：1)P<0.01；與Hcy組比較：2)P<0.01；下表同

2.3 siRNA沉默Cav-1后，各組Cav-1表達(dá)的變化 利用siRNA選擇性沉默Cav-1后，Cav-1蛋白表達(dá)顯著降低；Hcy組Cav-1 mRNA表達(dá)量0.87±0.16，Hcy+siRNA組為0.14±0.13組間比較差異顯著(P<0.01)。提示siRNA成功抑制Cav-1表達(dá)。見圖3。

2.4 Cav-1沉默后，Res對NO系統(tǒng)表達(dá)的影響 Cav-1沉默后，eNOS表達(dá)顯著上調(diào)；給予不同濃度Res后，eNOS的表達(dá)未觀察到明顯變化。見圖4，表2。

圖3 siRNA沉默Cav-1后，各組Cav-1表達(dá)變化

0：NC組；1：Hcy組；2：Hcy+siRNA組；3～5：Hcy+Res(0.1、1、10 μmol/L)組圖4 Res對NO系統(tǒng)表達(dá)的影響

組別eNOS/GAPDH比值NO(μmol/L)NC組0.99±0.14130.68±11.87Hcy組0.32±0.091)68.97±7.031)Hcy+siRNA組0.64±0.131)2)94.26±10.461)2)Hcy+Res(0.1μmol/L)組0.74±0.112)118.37±8.382)Hcy+Res(1μmol/L)組0.80±0.132)120.27±16.872)Hcy+Res(10μmol/L)組0.89±0.212)125.36±12.542)

3 討 論

高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病和長期抽煙常會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能異常，并進(jìn)一步促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展〔4〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO一方面對于血管內(nèi)皮的舒張至關(guān)重要，另一方面也具有較強(qiáng)的抗炎及抗血栓形成作用，能夠有效抑制AS的形成。因此，常作為血管內(nèi)皮功能的指示分子〔5〕。

在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，有眾多因子通過誘導(dǎo)Akt信號通路激活并抑制NO的生成進(jìn)而導(dǎo)致AS〔6〕。Xiao等〔7〕通過32P同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)能夠通過抑制Akt介導(dǎo)的eNOS在Ser1177位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放。Akt在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的過多激活會降低血液流速，縮小血管橫截面積，促進(jìn)AS的發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中，給予Hcy構(gòu)建HUVEC氧化應(yīng)激損傷模型后Akt表達(dá)明顯升高，提示Akt表達(dá)很可能與血管內(nèi)皮損傷存在聯(lián)系。Res能夠抑制ROS，減少細(xì)胞毒性作用和凋亡作用，保護(hù)線粒體膜及血管內(nèi)皮細(xì)胞。Res能夠通過抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮血管保護(hù)作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，Res能夠顯著下調(diào)HUVEC損傷模型中Akt的表達(dá)。當(dāng)給予Akt抑制劑后，Res仍然能夠進(jìn)一步促進(jìn)eNOS表達(dá)，提示在Akt通路上游，Res很可能有其他血管保護(hù)靶點(diǎn)。Taylor等〔8〕發(fā)現(xiàn)，eNOS能夠被細(xì)胞質(zhì)膜囊泡中的Cav-1調(diào)節(jié)，eNOS在囊泡內(nèi)主要被Cav-1蛋白抑制。上皮細(xì)胞內(nèi)的Ca2+-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物能夠阻斷Cav-1與eNOS之間的聯(lián)系并增強(qiáng)eNOS的活性。Cav-1敲除能夠極大提升eNOS的表達(dá)，Cav-1-/-與ApoE-/-雙敲除小鼠相對于ApoE-/-單敲除小鼠，低密度脂蛋白清除效率顯著降低，總膽固醇與甘油三酯顯著升高而高密度脂蛋白濃度無明顯變化〔9〕。本研究中，Cav-1沉默后eNOS表達(dá)顯著上升，提示Cav-1能夠直接調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)強(qiáng)度；而Res的血管保護(hù)作用很可能是通過Cav-1進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)Cav-1被敲除后，Res缺乏下游調(diào)節(jié)因子，不能夠進(jìn)一步調(diào)節(jié)NO系統(tǒng)。

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〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.D201210)

郭 麗(1972-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事循環(huán)系統(tǒng)疾病研究。

張 麗(1973-)，女，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事循環(huán)系統(tǒng)疾病研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)21-5238-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.010