， ， ， ， ， (河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 河南 洛陽 471003)

36份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜遺傳多樣性的鑒定與分析

孔欣欣，王春平，王黎明，董普輝，龐玉輝，張鵬飛
(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 河南 洛陽 471003)

為篩選抗麥長管蚜優(yōu)異的小麥種質(zhì)資源，以36份不同抗蚜水平的小麥種質(zhì)資源為材料，調(diào)查記錄不同時期供試材料的蚜蟲數(shù)量，并利用3對位于7 D染色體的特異性簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats，SSR)標記檢測材料，采用蚜量比值、Shannon’s 信息指數(shù)及聚類分析的方法進行分析，在分子水平上探討小麥抗麥長管蚜種質(zhì)資源的遺傳多樣性。分子檢測結(jié)果表明，引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121擴增條帶數(shù)平均為6.7條，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為5條、5條和2條；平均位點的有效等位基因數(shù)范圍為0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指數(shù)范圍0.000 0～1.329 7。聚類分析結(jié)果表明，36份小麥種質(zhì)資源按照閾值λ=2.06可分為4大類群，其中發(fā)現(xiàn)抗性品種矮抗58與其它品種具有較遠的親緣關(guān)系，可作為最新的抗蚜材料。

小麥； 種質(zhì)資源； 麥長管蚜； 遺傳多樣性； SSR分析

小麥是世界上重要的糧食作物之一，麥長管蚜是危害小麥的主要害蟲，且是各麥區(qū)小麥穗期(受害最敏感期)的優(yōu)勢麥蚜種群[1]。小麥每年產(chǎn)量因病蟲為害損失20%左右，其中麥蚜損害為10%～15%[2]。目前，化學(xué)抗蟲是最常用的防治麥蚜方法，大面積的使用化學(xué)農(nóng)藥會殺害蚜蟲的早期天敵[3]。因此，培育、篩選和利用抗蚜品種是防治麥蚜最經(jīng)濟有效的措施，同時也最有利于天敵和環(huán)境的保護[4-5]。

近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者對小麥種質(zhì)資源及其抗蚜性的遺傳差異和進化做了相關(guān)研究。Peng等[6]用51對SSR引物對71份小麥品種進行遺傳多樣性分析，得出SSR標記的平均等位變異位點為6.7個。倪中福等[7]用23個SSR引物對不同生態(tài)區(qū)的6個春小麥品種(系)及北方冬麥區(qū)的17個冬小麥品種(系)進行了遺傳多樣性分析，獲得平均變異位點為2.9個。仇松英等[8]利用18對SSR引物對47份麥蚜抗性不同的小麥品種進行了遺傳多樣性分析，平均變異位點有5.2個。王春平等[9]選用32對多態(tài)性穩(wěn)定的SSR標記對14份麥長管蚜抗性不同的小麥品種進行了遺傳多樣性分析，平均等位變異為6.8個。史忠良等[10]利用19對多態(tài)性SSR標記分析47份抗麥紅吸漿蟲品種(系)的遺傳多樣性分析，平均變異位點為5.47個。許蘭杰等[11]利用54對多態(tài)性的SSR引物對43份不同抗蚜水平小麥品種(系)進行遺傳多樣性分析，獲得平均等位變異為6.7個。

前人應(yīng)用SSR分子標記研究了小麥品種抗蚜性的遺傳多樣性[5,12-14]，但對于小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜的表型和基因型一致性以及分子標記開發(fā)的相互驗證在國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究以36份不同抗蚜水平的小麥種質(zhì)資源為材料，調(diào)查記錄不同時期供試材料的蚜蟲數(shù)量，并利用3對位于7 D染色體的特異性簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats，SSR)標記檢測材料，采用蚜量比值、Shannon’s信息指數(shù)及聚類分析的方法進行分析，在分子水平上探討小麥抗麥長管蚜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，以期明確小麥抗蚜種質(zhì)資源的遺傳多樣性、親緣關(guān)系以及標記的應(yīng)用功效，為小麥抗蟲育種的應(yīng)用提供親本材料和分子水平上的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

36份小麥種質(zhì)資源(見表1)：從本課題組前期研究的小麥種子資源中，選擇性狀穩(wěn)定的88份供試材料進行田間抗蚜鑒定，根據(jù)2年重復(fù)資料結(jié)果，從中又選擇具有不同抗性且抗性結(jié)果較為穩(wěn)定的36份材料作為研究對象。試驗材料由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種課題組提供，分別于2012—2013年度和2013—2014年度種植在河南科技大學(xué)試驗田，完全隨機設(shè)計，每份供試材料播種2行，行長為1 m，行距為0.24 m，重復(fù)3次，保護行種植千斤早作為對照，常規(guī)大田管理，整個生育期均不噴灑農(nóng)藥。

表1 36份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜鑒定

小麥種質(zhì)資源蚜情指數(shù)抗性級別小麥種質(zhì)資源蚜情指數(shù)抗性級別小麥種質(zhì)資源蚜情指數(shù)抗性級別煙農(nóng)190．5311MR大唐9910．3885HR千斤早2．1801HS陜糯1號0．3713MR石新7330．6786LR邯61720．7253LR中33990．327MR周麥190．2213HR豫麥491．1286LSAMIGO0．6712LRASTRON0．627LR186TM0．5458MR長武6130．2852HR周麥180．5458MR中8891．2079LS9631．1605LS小偃220．3467MR濟麥170．4327MR植952400．4745MR98?10?350．5655MR遠豐1390．9319LSZB070．4131MR荔高6號0．4844MR04?F6?8160．7794LR豫麥700．772LRPI2626600．895LRPI2949940．5311MRPI高0．627LR小偃2160．3073MR陜5340．8851LR東旱1號0．8286LR周優(yōu)190．7888LR遠豐1752．3186HS矮抗580．1746HR周911770．8433LRZB0111．2638MS

注：HR、MR、LR、LS、MS、HS分別表示對麥長管蚜蟲表現(xiàn)為高抗、中抗、低抗、低感、中感和高感。

1.2 抗蚜性鑒定方法

抗蚜性鑒定方法參考曹如槐[15]的蚜情指數(shù)法，稍有改動：采用田間自然感蚜，在灌漿成熟期按“Z”字型隨機選取10株小麥，調(diào)查記錄每株主莖麥長管蚜數(shù)，隔7 d調(diào)查1次，共調(diào)查5次。參照Painter[16]分級標準，以蚜情指數(shù)作為抗性評價的指標，抗性程度分為7級：免疫、高抗、中抗、低抗、低感、中感、高感，蚜情指數(shù)分別為0.00、0.01～0.30、0.31～0.60、0.61～090、0.91～1.20、1.21～1.50、gt;1.50。

1.3 SSR標記分析

取幼嫩葉片用十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB)法[17]提取小麥種質(zhì)資源的DNA。本研究利用前期[9,18]選取的位于小麥A、B和D組同源染色體組上的175對SSR分子標記進行了全基因組的篩選，鑒定出了有多態(tài)性的32對引物，篩選出3對特異性SSR標記。3對SSR標記序列參照Rder等[19]和Somers等[20]研究和相關(guān)網(wǎng)站SSR引物的序列信息，由Invitrogen生物工程公司合成。聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)反應(yīng)體系50μL：10×Buffer(含Mg2+)，2 UTaqDNA聚合酶，200μmol/L dNTPs，引物0.4 mol/L，50 ng模板DNA，體積用超純水補足。選用PTC-200 PCR儀：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)電泳分離PCR產(chǎn)物，銀染顯色后觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計方法

SSR標記檢測結(jié)果采用0/1賦值法，在相同的遷移位置上有擴增條帶，有帶記為1，無帶記為0，構(gòu)建0，1二元數(shù)據(jù)矩陣。利用Excel計算蚜情指數(shù)；利用Popgene 1.32[21]軟件包計算Shannon’s信息指數(shù)和平均位點有效等位基因數(shù)；利用DPS 7.05(Data Processing System)版軟件計算相似系數(shù)遺傳距離進行聚類分析。計算公式如下：

2 結(jié)果分析

2.1 36份小麥種質(zhì)資源抗性鑒定分析

在前期大面積篩選抗蚜種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，采用自然感蚜的方法，對多年穩(wěn)定的88份供試材料進行抗性鑒定，并從中又選擇具有不同抗性且抗性結(jié)果較為穩(wěn)定的36份材料作為研究對象，詳細結(jié)果見表1。由表1可知，36份小麥種質(zhì)資源中，表現(xiàn)高抗(HR)的材料有3份，包括矮抗58、周麥19、長武613；中抗(MR)材料有14份；低抗(LR)材料有12份；低感(LS)材料有3份；高感(HS)材料有2份。

表3 36份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜性的遺傳多樣性水平

小麥種質(zhì)資源AeⅠ小麥種質(zhì)資源AeⅠ小麥種質(zhì)資源AeⅠ千斤早0．12800．0838PI2949940．11950．0393遠豐1390．13940．1567陜糯1號0．26670．2310PI2626600．11950．0393中8890．30000．3662中33990．16670．0000豫麥490．48000．3662大唐9910．22500．4945ZB0110．19420．4500石新7330．27550．1797周優(yōu)190．24320．1283小偃220．18620．0393ASTRON0．11950．0393周911770．13040．0838ZB070．13040．0838荔高6號1．08000．6365濟麥170．65750．5973AMIGO0．19100．4107周麥191．08000．636504?F6?8160．27550．1797東旱1號0．27550．1797矮抗581．02801．3297煙農(nóng)190．49940．5459植952400．14060．1283中186TM0．11950．0393邯61720．31990．7324長武6130．74190．522998?10?350．13040．0838遠豐1750．20000．4500PI高0．13040．0838陜5340．12800．0838周麥181．08000．6365中9630．44710．4107小偃2160．75000．1352豫麥700．60000．5014

注:Ae表示平均每位點有效等位基因數(shù);I表示Shannon’s信息指數(shù)。

注：1～36編號同表;M:DNA標準分子量；R：抗性種質(zhì)條帶；S：敏感種質(zhì)條帶。圖1 Xwmc182標記對36份小麥種質(zhì)資源的SSR檢測結(jié)果

2.2 SSR標記的多態(tài)性分析

從本課題前期研究[9]所得出的32對引物中，篩選出了3對位于7D染色體上條帶清晰、重復(fù)性較好的特異性引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121，對篩選出的36份具有不同抗性的小麥種質(zhì)資源進行檢測，詳細結(jié)果見表2。由表2可知，Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121標記的擴增條帶數(shù)分別是8條、9條和3條，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為5條、5條和2條，平均每條引物能擴增出條帶數(shù)6.7條，多態(tài)位點百分率為55.7%～66.7%。其中，圖1為Xwmc182標記擴增的SSR產(chǎn)物電泳圖，其帶型分布與小麥種質(zhì)資源抗性鑒定結(jié)果一致。

表2 SSR標記檢測結(jié)果的多態(tài)性分析

代號標記擴增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)(%)多態(tài)位點百分率(%)1Xgwm448562．52Xwmc1829555．73Xwmc1213266．7

2.3 36份小麥種質(zhì)資源抗蚜性的遺傳多樣性分析

采用0/1賦值法對SSR標記檢測結(jié)果構(gòu)建0，1二元數(shù)據(jù)矩陣，利用軟件包計算Shannon’s信息指數(shù)和平均位點有效等位基因數(shù)，詳細結(jié)果見表3。由表3可知，36份不同抗性水平的小麥種質(zhì)資源中，平均位點的有效等位基因數(shù)的范圍為0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指數(shù)的范圍為0.000 0～1.329 7。說明36份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜的遺傳多樣性相對豐富。其中，矮抗58的遺傳多樣性最高，Ae值和I值分別為1.028 0、1.329 7；周麥19、荔高6號、周麥18次之，Ae值和Ⅰ值分別均為1.080 0、0.636 5；中3399最低，Ae值和Ⅰ值分別為0.166 7、0.000 0。36份小麥種質(zhì)資源的平均位點有效等位基因數(shù)為0.363 9，Shannon’s信息指數(shù)為0.308 5。SSR標記結(jié)果反映了36份小麥種質(zhì)資源抗性遺傳變異的程度，說明36份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜的遺傳多樣性很豐富。

2.4 小麥種質(zhì)資源抗蚜性的聚類分析

根據(jù)SSR標記的數(shù)據(jù)結(jié)果，計算出36份小麥種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)矩陣，結(jié)合UPGMA法構(gòu)建種質(zhì)資源間的聚類分析圖(圖2)。按照閾值為標準，36份小麥種質(zhì)資源可分為4大類。第1類包括千斤早、石新733、遠豐139、ZB011、899、963、豫麥49、遠豐175；第2類包括陜糯1號、周優(yōu)19、3399、小偃22、ZB 07、PI高、98-10-35、周91177、PI 294994、186 TM、PI 262660、ASTRON、東旱1號、04-F 6-816、植95240、陜534、AMIGO、大唐991、邯6172、濟麥17、煙農(nóng)19、豫麥70；第3類包括小偃216、長武613、周麥18、荔高6號、周麥19；第4類包括矮抗58。其中，第1類為敏感型的種質(zhì)資源，第2類包含低抗、中抗型的種質(zhì)資源，第3類包含中抗、高抗型的種質(zhì)資源，第4類為高抗型的種質(zhì)資源。

圖2 36份小麥種質(zhì)資源的聚類分析圖

3 討 論

分析小麥種質(zhì)資源抗蚜遺傳多樣性是保護、開發(fā)和利用種質(zhì)資源的前提。目前，SSR分子標記是遺傳多樣性研究較為有效的方法。本研究是在本課題組[9]前期研究基礎(chǔ)上，篩選出的3對位于7 D染色體上條帶清晰、重復(fù)性好的特異性引物，對36份具有代表性的小麥種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，平均每條引物能擴增出條帶數(shù)為6.7條。研究結(jié)果與Peng等[6]抗俄羅斯雙尾蚜小麥種質(zhì)資源微衛(wèi)星標記分析、許蘭杰等[11]不同抗蚜水平小麥品種(系)SSR分析6.7條的結(jié)果一致，且與本課題組前期[9]小麥品種SSR分析6.8條的結(jié)果幾乎一致，驗證了SSR標記的重復(fù)可用性，為以后本課題開發(fā)利用抗蚜功能標記奠定了基礎(chǔ)。

對品種進行聚類分析，是研究品種間遺傳差異和雜交育種親本選配的重要參考依據(jù)。從當前抗蚜育種的形勢來看，了解抗蚜品種間的遺傳差異對于抗蚜品種的選育具有重要意義。本研究以相對距離為2.06時將36個具有不同抗性的材料聚為4大類群。聚類結(jié)果與Peng等[8]、王春平[9]、許蘭杰等[11]的結(jié)果不一致，這與研究材料的不同、所用檢測標記的類型及抗蚜機制的不一致有關(guān)；試驗材料為36份具有不同抗性的小麥種質(zhì)資源，聚類結(jié)果為4大類是可行的，這些材料的表型和基因型結(jié)果基本一致，其中表型為低抗型的石新733被聚類到敏感型的種質(zhì)資源中，匹配率為97.2%，分析結(jié)果可靠，可作為分子標記輔助育種中抗蟲育種的親本材料。

4 結(jié) 論

本研究利用3對SSR標記對36份小麥種質(zhì)資源進行檢測，采用蚜量比值、Shannon’s信息指數(shù)及聚類分析的方法進行分析，得出的主要結(jié)論如下：

1) 36份小麥種質(zhì)資源中，表現(xiàn)高抗(HR)的材料有3份，包括矮抗58、周麥19、長武613；中抗(MR)材料有14份；低抗(LR)材料有12份；低感(LS)材料有3份；高感(HS)材料有2份。

2) 引物Xgwm44、Xwmc182和Xwmc121擴增的條帶數(shù)分別是8條、9條和3條，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為5條、5條和2條，平均每條引物能擴增出條帶數(shù)6.7條，多態(tài)位點百分率為55.7%～66.7%。

3) 36份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜的遺傳多樣性相對豐富，平均位點的有效等位基因數(shù)的范圍為0.119 5～1.080 0，Shannon’s信息指數(shù)的范圍為0.000 0～1.329 7。

4) 36份小麥種質(zhì)資源可分為4大類。其中，第1類占8份，屬于敏感型的種質(zhì)資源；第2類占22份，屬于抗型的種質(zhì)資源；第3類占5份，屬于中高抗型的種質(zhì)資源；第4類僅一份(矮抗58)，屬于高抗型的種質(zhì)資源。

[1]李賢慶,郭線茹,李克斌,等.不同小麥品種(系)對麥長管蚜的抗性[J].昆蟲學(xué)報,2006,49(6):963-968.

[2]白莉,鄭王義,任東植,等.麥長管蚜為害損失估計及防治閾值研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(1):61-64.

[3]張乃芹,侯傳本,于凌春,等.麥田主要天敵昆蟲種群動態(tài)及對麥蚜控制效應(yīng)的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(5):86-88.

[4]李鳳珍,吉萬全,吳金華.小麥抗蚜研究新進展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,32(1):73-77.

[5]段燦星,王曉鳴,朱振東,等.我國小麥抗麥長管蚜(Sitobionavenae)研究概況[J].植物遺傳資源學(xué)報,2003,4(2):175-178.

[6]Peng J H,Bai Y,Haley S D,et al.Microsatellite-based Molecular Diversity of Bread Wheat Germplasm and Association Mapping of Wheat Resistance to the Russion Wheat Aphid[J].Genetica,2009,135(9):99-122.

[7]倪中福,張義榮,梁榮奇,等.普通小麥D染色體組微衛(wèi)星分子標記遺傳差異研究[J].作物學(xué)報,2003,29(1):145-151.

[8]仇松英,張松令,史忠良,等.小麥抗蚜品種的遺傳多樣性SSR標記分析[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報,2011,1(2):5-10.

[9]王春平,羅 坤,趙惠燕,等.14份小麥種質(zhì)資源抗麥長管蚜遺傳多樣性的SSR分析[J].核農(nóng)學(xué)報,2011,25(4):639-644.

[10]史忠良,仇松英,張松令,等.小麥抗麥紅吸漿蟲品種的遺傳多樣性分析[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報,2011,1(1):10-16.

[11]許蘭杰,侯起嶺,侯春雨,等.不同抗蚜性小麥品種(系)的遺傳多樣性SSR標記分析[J].華北農(nóng)學(xué)報,2014,29(5):119-124.

[12]段燦星,王曉鳴,朱振東.小麥種質(zhì)對麥長管蚜的抗性鑒定與評價[J].植物遺傳資源學(xué)報,2006,7(3):297-300.

[13]Arzani A,Peng J,Lapitan N.DNA and Morphological Markers for a Russian Wheat Aphid Resistance Gene[J].Euphytica,2004,139(2):167-172.

[14]Han Y,Wang Y,Bi J,Yang X.Constitutive and Induced Activities of Defense-related Enzymes in Aphid-resistant and Aphid-susceptible Cultivars of Wheat[J].Journal of chemical ecology,2009,35(2):176-182.

[15]曹如槐.農(nóng)作物抗病蟲性鑒定方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1992.

[16]Painter R H.Resistance of Plants to Insects[J].Ann Rev Entomol,1958,3:267-290.

[17]Sharppj,Kreis M,Sheway P R,et al.Location of β-amylase Sequence in Wheat and Its Relatives[J].Theor Appl Genet,1988,75:286-290.

[18]Chun-ping Wang,Zheng-hong Wang,Hui-yan Zhao,et al.Expression of Resistance Genes to the Grain Aphid,Sitobionavenaein Wheat,Triticumaestivum.Journal of insect science.2013,13:90-100.

[19]Marion S Roder,Victor Korzum, katia wendehake,et al.Ganal.Amicrosa Tellite Map of Wheat[J].Genetic s,1998,149(4):2 007-2 023.

[20]Somers D,Isaac P,Edwards K.A high-density Microsatellite Consensus Map for Bread Wheat (TriticumaestivumL.)[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,109(6):1 105-1 114.

[21]Yeh F,Rong Cai Y,Boyle T.Popgene Version 1.31 Microsoft Window Based Freeware for Population Genetic Analysis.Quick user guide university of alberta[M].Center for International Forestry Research,1998.

Identification and Analysis of Genetic Diversity of Resistant to Sitobion Avenae of 36 Wheat Germplasm

KONGXinxin,WANGChunping,WANGLiming,DONGPuhui,PANGYuhui,ZHANGPengfei

2016-06-19

人才基金(編號：09001595);國家自然基金(編號：U 1304320和U 1304318)。

孔欣欣(1991—)，女，碩士研究生，主要從事小麥遺傳育種；E-mail：434379563@qq.com。

王春平(1969—)，女，碩士生導(dǎo)師，主要從事小麥遺傳育種和種子工程的研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.062

S 512.1

A

1001-4705(2016)11-0062-05