， ， (天津市植物保護(hù)研究所， 天津 300381)

黃瓜種子攜帶真菌的檢測(cè)研究

高葦，王勇，張春祥
(天津市植物保護(hù)研究所， 天津 300381)

為明確不同黃瓜品種種子攜帶真菌的種類及其帶菌率差異，采用洗滌法和PDA平板法對(duì)12個(gè)黃瓜栽培品種進(jìn)行種子外部和內(nèi)部帶菌檢測(cè)。結(jié)果表明，供試種子外部帶菌量差異較大，分離真菌的種類主要為青霉(Penicilliumspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)、木霉(Trichodermaspp.)、根霉(Rhizopusspp.)等腐生菌及鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、蛭孢(Cladosporiumspp.)等疑似病原真菌。種子內(nèi)部寄藏真菌較少，疑似病原菌檢出率顯著降低，其中攜帶的鐮刀菌分離頻率最高，種殼內(nèi)表皮的帶菌率顯著高于種胚。

黃瓜； 種子； 寄藏真菌； 帶菌檢測(cè)

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)資料，其質(zhì)量直接決定農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量。在種子生產(chǎn)、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過程中，會(huì)與多種微生物接觸，從而導(dǎo)致種子帶菌。種子生產(chǎn)過程中易接觸到植物病原菌，種子攜帶的病原菌可以作為植物病害的初侵染源，成為病害傳播的主要途徑[1]；種子儲(chǔ)藏或運(yùn)輸時(shí)，攜帶的非致病菌可能對(duì)種子質(zhì)量及其萌發(fā)或活力造成影響[2]。種子的安全生產(chǎn)、種子帶菌的檢測(cè)和處理是確保農(nóng)作物安全生產(chǎn)的首要前提。

黃瓜是我國(guó)主要的蔬菜栽培品種，在其整個(gè)生長(zhǎng)過程中會(huì)受到多種植物病原真菌的侵染，其中部分病原真菌可以在土壤和種子上越冬越夏成為下茬初侵染源。目前，生產(chǎn)上對(duì)病害的防治倡導(dǎo)選用抗病品種、生物防治、化學(xué)防治等綜合防控手段，而對(duì)于其種傳病原真菌的控制最有效的措施就是及時(shí)檢測(cè)，及時(shí)采取種子消毒及種衣劑包衣等預(yù)防措施[3]。目前，關(guān)于黃瓜種子攜帶真菌種類的調(diào)查鑒定的相關(guān)報(bào)道較少，研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子上可檢測(cè)到的真菌有7～8種[4-5]，檢測(cè)到的病原菌較少[6-7]。本研究參考國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程和農(nóng)作物種子健康檢測(cè)方法[8]，以黃瓜種子為研究對(duì)象，對(duì)收集的天津和北京地區(qū)未包衣的黃瓜種子進(jìn)行其攜帶真菌檢測(cè)與鑒定，以期明確黃瓜種子帶菌量及主要的優(yōu)勢(shì)真菌類型，為生產(chǎn)中黃瓜種子的藥劑消毒處理和種衣劑的選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜品種共12個(gè)，分別為:來自天津的黃瓜品種津春3號(hào)、津春4號(hào)、德瑞特D 19號(hào)，博新20號(hào)和德瑞特2號(hào)；來自北京的黃瓜品種中農(nóng)5號(hào)、中農(nóng)6號(hào)、中農(nóng)8號(hào)、中農(nóng)10號(hào)和中農(nóng)12號(hào)；來自山東的黃瓜品種山東密刺和春秋大豐1號(hào)。

1.2 種子帶菌檢測(cè)

1.2.1 種子外部攜帶真菌的檢測(cè)

將12個(gè)黃瓜品種隨機(jī)各選取200粒種子，放入250 mL的三角瓶中，加入50 mL的無菌水，在25 ℃，120 r/min的搖床上充分振蕩1 h。然后收集懸浮液10 mL于已滅菌的離心管中，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，去上清液，沉淀即為收集的菌體等。加入少量的無菌水使沉淀懸浮，并對(duì)其進(jìn)行10倍系列的梯度稀釋，每個(gè)稀釋度菌懸液100μL涂布于9 cm的加有鏈霉素的PDA平板上，每個(gè)濃度3皿重復(fù)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d觀察平板上的菌落，根據(jù)稀釋倍數(shù)和種子檢測(cè)數(shù)計(jì)算種子外部攜帶真菌的孢子負(fù)荷量和檢出真菌的比例[2]。孢子負(fù)荷量(個(gè)/粒)=每皿菌落總數(shù)/0.1 mL×稀釋倍數(shù)×50 mL/200粒，分離比例(%)=某類真菌菌落數(shù)/菌落總數(shù)×100%。

1.2.2 種子內(nèi)部攜帶真菌的檢測(cè)

將各品種100粒黃瓜種子在1% NaClO溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3遍，取45粒種子在無菌的條件下將其種殼和種胚解剖開；將種胚再放置在1%NaClO溶液中浸泡3 min，用無菌水沖洗3遍。將晾干后的種殼(內(nèi)殼朝下)、種胚均勻的擺放在直徑為9 cm的有鏈霉素的PDA平板上，每皿15粒種子組織塊，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d觀察平板上的菌落數(shù)。種子帶菌率(%)=帶菌種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù)×100%；某特定菌分離頻率(%)=帶某類菌種子數(shù)/帶菌種子總數(shù)×100%。

表1 供試黃瓜種子外部分離的真菌及其分離頻率

供試品種孢子負(fù)荷量分離到真菌的種類及分離頻率(%)鐮刀菌鏈格孢蛭孢木霉青霉毛霉根霉曲霉其它津春3號(hào)972a18．523．702．473．7022．2220．993．70—24．69津春4號(hào)66de5．453．641．8221．8212．7316．36—32．735．45德瑞特D19號(hào)68．4de14．04—3．5128．07—17．5412．28—24．56博新20號(hào)732b9．846．561．649．8421．3119．678．20—22．95德瑞特2號(hào)82．8d14．4915．944．35—20．2917．391．4524．641．45中農(nóng)5號(hào)64．8de—9．26—9．26—20．373．7031．4829．63中農(nóng)6號(hào)576c2．0814．58—16．6718．75—12．50—35．42中農(nóng)8號(hào)69．6de5．176．903．4518．97—24．148．6213．7918．97中農(nóng)10號(hào)62．4de3．85——19．2332．695．77—11．5426．92中農(nóng)12號(hào)38．4ef3．1318．759．38—15．636．25—34．3812．50山東密刺948a15．196．332．535．0611．3925．328．861．2724．05春秋大豐1號(hào)74．4de3．2316．13—11．2922．5811．29—25．819．68

1.3 種傳真菌初步鑒定

將分離到的真菌進(jìn)行純化、鏡檢和保存。根據(jù)真菌的培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)特征，參照工具書及鑒定資料進(jìn)行分類鑒定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜種子外部攜帶真菌

通過洗滌離心法和PDA平板法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同黃瓜種子攜帶的真菌具有較大的差異(表1)，山東密刺和津春3號(hào)外部帶菌量最高，每粒種子攜帶孢子量達(dá)到900多，顯著高于其它品種；博新20號(hào)種子攜帶孢子量為732；其它品種的種子孢子帶菌量低于100，各品種間差異不顯著；其中，中農(nóng)12號(hào)種子帶菌量最低。

從12個(gè)黃瓜品種的種子上分離到的疑似致病菌為鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、蛭孢(Cladosporiumspp.)，其中鐮刀菌的分離頻率最高，津春3號(hào)、德瑞特D 19號(hào)、德瑞特2號(hào)和山東密刺上鐮刀菌的分離率在15%左右；其次是鏈格孢菌，德瑞特2號(hào)、中農(nóng)6號(hào)和春秋大豐1號(hào)上該病原的分離率在15%左右；蛭孢菌的分離率較低。鐮刀菌、鏈格孢菌也是腐生菌的一種，所以對(duì)分離到的疑似病原菌還需進(jìn)一步的致病力鑒定確定其是否為病原菌。通過分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北京中農(nóng)系列品種的帶菌率顯著低于天津的幾個(gè)品種。另外，通過分離發(fā)現(xiàn)黃瓜種子表皮攜帶的腐生菌種類主要為木霉(Trichodermaspp.)、青霉(Penicilliumspp.)、毛霉(Mucorspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)等。不同品種黃瓜上腐生菌的主要類群差異較大。

2.2 黃瓜種子內(nèi)部攜帶真菌

對(duì)不同黃瓜品種種子內(nèi)部攜帶真菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定，結(jié)果表明，供試品種種子內(nèi)部攜帶真菌種類差異不顯著，與種子外部攜帶真菌種類相似，帶菌量顯著低于種子表皮，種子內(nèi)部種胚和內(nèi)殼表皮帶菌率最高的品種均為山東密刺，帶菌率分別為33.33%和53.33%(表2和表3)。種胚帶菌率介于0～33.33%，中農(nóng)系列種子種胚帶菌率均較低，其中中農(nóng)6號(hào)胚上未分離到真菌。種胚上攜帶的真菌多為腐生菌，攜帶的致病菌以鐮刀菌居多，津春3號(hào)、津春4號(hào)、德瑞特2號(hào)、山東密刺和春秋大豐1號(hào)上均分離到了鐮刀菌；其次是鏈格孢，在津春3號(hào)和中農(nóng)5號(hào)分離培養(yǎng)到了鏈格孢菌；在供試品種上均未分離到蛭孢菌。德瑞特D 19號(hào)、博新20號(hào)、中農(nóng)6號(hào)、中農(nóng)8號(hào)、中農(nóng)10號(hào)和中農(nóng)12號(hào)6個(gè)品種上未分離到致病菌。種子內(nèi)部種殼內(nèi)表皮帶菌率明顯高于種胚。德瑞特D 19號(hào)、博新20號(hào)、中農(nóng)6號(hào)和中農(nóng)8號(hào)4個(gè)品種種殼上未分離到致病菌。

表2 供試黃瓜種子種胚寄藏疑似病原真菌及其分離頻率

供試品種種子帶菌率(%)分離頻率(%)鐮刀菌鏈格孢蛭孢其它津春3號(hào)26．678．3316．67—75．00津春4號(hào)17．7825．00——75．00德瑞特D19號(hào)22．22———100．00博新20號(hào)13．33———100．00德瑞特2號(hào)24．4427．27——72．73中農(nóng)5號(hào)11．11—40．00—60．00中農(nóng)6號(hào)0．00————中農(nóng)8號(hào)8．89———100．00中農(nóng)10號(hào)6．67———100．00中農(nóng)12號(hào)11．11———100．00山東密刺33．3326．67——73．33春秋大豐1號(hào)15．5614．29——85．71

表3 供試黃瓜種子種殼內(nèi)部寄藏疑似病原真菌及其分離頻率

供試品種種子帶菌率(%)分離頻率(%)鐮刀菌鏈格孢蛭孢其它津春3號(hào)42．2215．7915．79—68．42津春4號(hào)24．449．09——90．91德瑞特D19號(hào)22．22———100．00博新20號(hào)28．89———84．62德瑞特2號(hào)26．6716．67—8．3375．00中農(nóng)5號(hào)22．22—20．00—80．00中農(nóng)6號(hào)8．89———100．00中農(nóng)8號(hào)22．22———100．00中農(nóng)10號(hào)17．78—37．50—62．50中農(nóng)12號(hào)15．5614．29——85．71山東密刺53．3325．008．33—66．67春秋大豐1號(hào)26．6725．00——75．00

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)天津、北京和山東地區(qū)生產(chǎn)的黃瓜品種采用洗滌離心和PDA平板培養(yǎng)的方法對(duì)種子表皮、種子內(nèi)殼和種胚上攜帶的真菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同黃瓜品種上攜帶的真菌主要包括疑似種傳病原菌和部分腐生菌。疑似病原菌為鐮刀菌、鏈格孢和蛭孢菌，其中鐮刀菌是一種主要的種傳根部病原菌，鏈格孢和蛭孢菌可以引起黃瓜葉片發(fā)生黑斑病和黑星病，本研究從供試品種上均分離到了這3種病原菌，但由于其也可能是一種腐生菌，所以對(duì)于分離到的疑似病原菌的致病性仍需進(jìn)一步的接種試驗(yàn)證明。通過分離培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子上攜帶的真菌種類與西瓜、玉米、水稻等其他作物具有一定的相似性[2,10-13]，種子表皮攜帶的真菌多為腐生菌，分離到的病原菌較少。種子內(nèi)部攜帶的真菌數(shù)量顯著低于種子表皮，其中種胚上攜帶的真菌數(shù)量最低。通過分離培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)德瑞特D 19號(hào)、博新20號(hào)、中農(nóng)6號(hào)和中農(nóng)8號(hào)4個(gè)品種僅分離到了腐生菌，未分離到致病菌。對(duì)于種胚和種子內(nèi)殼上分離到疑似病原菌的品種，其病原菌的致病性有待進(jìn)一步的研究探討，以衡量其生產(chǎn)使用的安全性。

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Testing of Seed-Associated Fungi of Cucumber Seed

GAOWei，WANGYong，ZHANGChunxiang

2016-04-28

天津市自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目“多主棒孢毒素cassiicolin對(duì)黃瓜致病機(jī)制的研究”(編號(hào)：13 JCQNJC 14900)。

高 葦(1982—)，女，遼寧瓦房店市人；助理研究員，博士，主要從事植物病原真菌的檢測(cè)和防治方面的研究；E-mail:gaowei5277@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.091

S 642.2； S 432.1

A

1001-4705(2016)09-0091-03