劉芳，肖洋，李祝*，郭博愷，胡綿綿，冉江，郭崇韜

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽550004；3.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550025）

黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)兩種植物病菌的抑制作用

劉芳1，肖洋2，李祝1*，郭博愷3，胡綿綿1，冉江1，郭崇韜1

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽550004；3.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550025）

黑曲霉是集安全和具有許多活性強(qiáng)大酶系等諸多優(yōu)點(diǎn)于一身的優(yōu)良工業(yè)發(fā)酵用菌種。研究分離得到一株黑曲霉（Aspergillus niger）xj，為充分開發(fā)利用這一真菌資源，利用50 g含有1×109CFU/g、5×109CFU/g、15×109CFU/g黑曲霉孢子的干燥孢子體粉末提取出三種不同的浸膏，并在篩選最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)長的基礎(chǔ)上對(duì)這3種浸膏進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這3種浸膏對(duì)青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）及根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）這兩種常見植物病菌均體現(xiàn)了良好的抑制效果，且抑制率均＞92.02%。

黑曲霉；粗提物；植物病菌；抑菌作用

植物病菌每年均使我國在農(nóng)業(yè)方面產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是兩種常見的植物病菌。青枯雷爾氏菌對(duì)許多農(nóng)產(chǎn)品都有病害作用，可侵染44個(gè)科的數(shù)百種植物[1]，包括許多重要的經(jīng)濟(jì)作物（如馬鈴薯、花生等）[2]，由青枯雷爾氏菌引起的煙草青枯病已迅速擴(kuò)展蔓延至主要產(chǎn)煙國家，成為制約煙草生產(chǎn)的主要病害[3]，同時(shí)也是威脅世界煙草生產(chǎn)的一大毀滅性病害[4]。該病對(duì)我國僅七個(gè)省煙草業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失每年就高達(dá)兩千萬元以上[5]，此外，根癌農(nóng)桿菌也是一種世界性植物病菌，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]，在歐洲[7]、北美[8]及亞洲[9]的一些國家普遍發(fā)生，可侵染93科331屬643種雙子葉植物和少數(shù)裸子植物[10]。雖然現(xiàn)在有許多科學(xué)家都在研究對(duì)抗這些植物病菌的方法，如2005年薛慶云等[11]研究了青枯病的防治，而至今仍沒有有效的抑制方法；2013年由汪可寧等[12]結(jié)合了我國50年以來與植物病菌的對(duì)抗經(jīng)驗(yàn)提出，要想對(duì)植物病菌進(jìn)行良好的防治就必須從基因改良方面或者病原菌抑制方面入手；2016年馬超等[13]也提出消滅有害病菌，合理利用現(xiàn)有資源，建設(shè)資源節(jié)約環(huán)境友好的新型社會(huì)是當(dāng)今時(shí)代的主流，現(xiàn)在對(duì)植物病菌的生物防治研究中，已有利用拮抗抑制的報(bào)道，而黑曲霉作為一個(gè)安全的優(yōu)勢發(fā)酵菌種，運(yùn)用在抗菌藥物研究與開發(fā)中的報(bào)道甚少[14]，此次實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上利用黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)青枯雷爾氏菌、根癌農(nóng)桿菌這兩種常見植物病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。最終達(dá)到分離出對(duì)根癌農(nóng)桿菌等植物病菌有高抑制活性的組分的目的，這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)將對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生重要影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株來源

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC NO：M206021。

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）Q11-2：分離自貴州省畢節(jié)地區(qū)大方縣煙草青枯病株，保存于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室，以下簡稱Q11-2。

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）T-37：購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所，以下簡稱T-37。

1.1.2藥品與試劑

注射用青霉素鉀（80萬）：四川金瑞克動(dòng)物藥業(yè)有限公司；注射用氨芐西林鈉：中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司；二甲基亞砜分析純：廣東光華科技股份有限公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈進(jìn)化設(shè)備科技有限公司；MLS-3750型獨(dú)立式高溫高壓滅菌鍋：北京諾匯誠科技有限公司；SKY-2112B雙層特大容量恒溫培養(yǎng)搖床：上海達(dá)平儀器有限公司；TopPette移液槍：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；759紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1黑曲霉孢子粉粗提物的制備

將50 g含有1×109CFU/g、5×109CFU/g、15×109CFU/g黑曲霉孢子的干燥孢子體粉末，用200 mL丙酮、60℃回流3 h，濾出丙酮并重復(fù)以上步驟2次，對(duì)三次濾液一起旋蒸，分別得到0.452 g、0.452 g、0.756 g浸膏初提物，設(shè)定編號(hào)為“1”、“2”、“3”。

1.3.2菌株Q11-2、T-37最大吸收波長的確定

將供試菌株先接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，再在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中分別接入一環(huán)Q11-2、T-37，在37℃、120 r/min的條件搖床培養(yǎng)12 h后取出，用759紫外可見分光光度計(jì)在波長300～650 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，確定其最大吸收波長。

由表3可知，近年來，隨著“一帶一路”倡議的實(shí)施，中約經(jīng)貿(mào)合作呈現(xiàn)良好發(fā)展態(tài)勢。中國和約旦的貿(mào)易總額，由2007年的11.95億美元增加到2016年的31.65億美元，年均增長率為11.4%。其中，中國對(duì)約旦的進(jìn)口額從2007年的0.821億美元增加到2016年的2.112億美元，年均增長率為11.1%，中國對(duì)約旦出口額由2007年11.13億美元增加到2016年的29.54億美元，年均增長率為11.5%。由此，在進(jìn)出口年均增長率基本相同的情況下，隨著貿(mào)易額的逐年增加，中國對(duì)約旦貿(mào)易順差也在逐年擴(kuò)大。

1.3.3測定藥篩時(shí)的最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)間

菌懸液制備：供試菌株先接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，再在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中分別接入一環(huán)Q11-2、T-37并在37℃、120 r/min的條件進(jìn)行搖床培養(yǎng)，制成Q11-2、T-37的菌懸液。

Q11-2最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)長的測定：在100 mL的液體培養(yǎng)基中按2.5%、5%、10%、15%、20%、25%的接種量接入Q11-2，并在37℃、120r/min的條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，分別在0h、1.5h、3h、4.5h、6h、7.5h、9h、10.5h、12h、13.5h、15 h、16.5 h、18 h取出3 mL在最適波長條件下測其OD值，每個(gè)處理三次重復(fù)。繪制出Q11-2的生長曲線，根據(jù)其生長曲線從而確定最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)長的范圍。

T-37最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)長的測定：在100 mL的液體培養(yǎng)基中按10%、15%、20%、25%、30%的接種量接入T-37，并在37℃、120 r/min的條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，且分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h、32 h取出3 mL在最適波長條件下測其OD值。繪制出T-37的生長曲線，根據(jù)其生長曲線從而確定最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)長的范圍。

1.3.4黑曲霉孢子粉粗提物的抑菌試驗(yàn)

分別在6 mL的液體培養(yǎng)基中加入60 μL用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制的質(zhì)量濃度為80 mg/mL的黑曲霉孢子粉粗提物（“1”、“2”、“3”）、等體積的DMSO及用無菌水配制的質(zhì)量濃度為80 mg/mL的陽性對(duì)照藥，在1.3.3確定的最適接種量的基礎(chǔ)上接入相應(yīng)的植物病原菌，并在37℃、120 r/min的條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，根據(jù)1.3.3確定的最佳培養(yǎng)時(shí)長培養(yǎng)一定時(shí)間后取出在最適波長條件下測定其OD值。進(jìn)而算出其抑菌率。

2　結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的確定

將不同菌的菌懸液在不同波長條件下測其OD值，結(jié)果見圖1。

圖1　青枯雷爾氏菌Q11-2(A)、根癌農(nóng)桿菌T-37(B)的紫外吸收光譜圖Fig.1　Ultraviolet absorption spectra ofRalstonia solanacearum Q11-2(A)andAgrobacterium tumefaciens(B)

從圖1可知，Q11-2最大吸收波長為420 nm，T-37的最大吸收波長為400 nm。

2.2最適接種量及最佳培養(yǎng)時(shí)長的測定

通過測定Q11-2、T-37在不同接種量下的生長曲線來進(jìn)行最佳適接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)間的測定，結(jié)果見圖2。

圖2　青枯雷爾氏菌Q11-2(A)、根癌農(nóng)桿菌T-37(B)的生長曲線Fig.2　Growth curve ofRalstonia solanacearumQ11-2(A)and Agrobacterium tumefaciens(B)

由圖2（A）可知，Q11-2在各接種量條件下的生長曲線趨勢幾乎完全相同，當(dāng)培養(yǎng)到達(dá)9 h時(shí)，達(dá)到穩(wěn)定生長期，當(dāng)培養(yǎng)15 h時(shí)，開始進(jìn)入衰亡期，所以確定Q11-2藥篩時(shí)的最佳培養(yǎng)時(shí)間為9～15 h。不同接種量對(duì)其生長曲線的吸光度值均在最佳范圍為0.1～0.8內(nèi)[15]，故均可以用來進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)采用10%的接種量進(jìn)行。由圖2（B）可知，T-37的不同接種量對(duì)其生長曲線的測定沒有顯著影響，10%～30%的接種量均可用于實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)采用10%的接種量進(jìn)行，培養(yǎng)達(dá)到16 h時(shí)開始進(jìn)入穩(wěn)定生長期，故T-37最佳培養(yǎng)時(shí)長為16 h。

2.3黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)Q11-2、T-37的抑菌試驗(yàn)

黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)Q11-2、T-37的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，黑曲霉孢子粉粗提物“1”、“2”、“3”對(duì)Q11-2和T-37都有良好的抑制效果，其抑制率均＞92.02%，其抑菌率均高于陽性對(duì)照藥的抑制效果，且從圖中可以看出其抑菌率由“1”～“3”均呈遞增趨勢。由此可初步得出一定質(zhì)量的黑曲霉孢子體粉末內(nèi)所含的孢子數(shù)越多，其抑菌效果越佳。

圖3　黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)青枯雷爾氏菌Q11-2(A)、根癌農(nóng)桿菌T-37(B)的抑菌結(jié)果Fig.3　Anti-bacteria results of crude extracts from spore powder of Aspergillus nigeronRalstonia solanacearumQ11-2(A)and Agrobacterium tumefaciens(B)

3　討論

黑曲霉xj是從患有冠癭病的葡萄樹根際土壤中分離獲得的，與植物病原菌有相似的生態(tài)環(huán)境，生長快，且分泌抑菌物質(zhì)多[16]，本研究利用黑曲霉孢子粉提取出3種粗提物，編號(hào)為“1”、“2”、“3”，同時(shí)利用青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）Q11-2、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）T-37兩種常見植物病菌作為指示菌，在利用不同接種量的生長曲線確定了藥篩實(shí)驗(yàn)的最佳接種量和最佳培養(yǎng)時(shí)長后對(duì)黑曲霉孢子粉粗提物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明黑曲霉孢子粉粗提物“1”、“2”、“3”對(duì)Q11-2及T-37均有良好的抑制效果，且抑制率均高達(dá)92.02%以上。通過此次研究，基本確定了黑曲霉孢子粉粗提物對(duì)Q11-2、T-37等常見植物病菌有良好的抑制作用，且其抑菌率隨著孢子數(shù)目的增多而升高，但其具體的抑菌機(jī)制還需要在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究和探索。

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Inhibition effect ofAspergillus nigerspores crude extracts on two botanic bacteria

LIU Fang1,XIAO Yang2,LI Zhu1*,GUO Bokai3,HU Mianmian1,RAN Jiang1,GUO Chongtao1
College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Province Product Quality Supervision and Inspection Institute,Guiyang 550004,China;3.College of Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Aspergillus nigeris an excellent industrial strain for fermentation,for it is safe and gathers many powerful active enzyme system.In the research,a strain ofA.nigerxj was isolated.In order to fully explore and utilize the fungus resources,50 g dry spoophyte powder containing 1×109CFU/g,5×109CFU/g,15×109CFU/g ofA.nigerspores was used respectively to extract three different extracts.Under the optimal inoculum and culture time,bacteriostasis experiments on three extract were carried out.Results showed that the three extracts showed good inhibition effect on Ralstonia solanacearumandAgrobacterium tumefaciens,and the inhibition rate was all higher than 92.02%.

Aspergillus niger;crude extracts;botanic bacteria;bacteriostasis

Q939.95

0254-5071（2016）10-0103-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.023

2016-06-22

貴州省科技廳社發(fā)項(xiàng)目（黔科合SY字[2014]3053）；國家自然科學(xué)基金（31460486）；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合NY [2014]3033）；貴州大學(xué)SRT項(xiàng)目

劉芳（1994-），女，本科生，研究方向?yàn)橹参锊『Ψ乐巍?/p>

李祝（1978-），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锊『Ψ乐巍?/p>