邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

尾菜液體青貯菌劑制備及應(yīng)用

邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

對植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SD2、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)SD4在5 L立瓶中分別進(jìn)行培養(yǎng)，制備尾菜液體青貯菌劑。結(jié)果表明，在MRS液體培養(yǎng)基中37℃條件下，調(diào)控pH值，菌株SD2和SD4最適收獲期分別為24 h、20 h，菌株SD2與SD4配比為2∶1時(shí)青貯效果最佳，尾菜液體青貯菌劑總活菌數(shù)＞1×109CFU/mL。按0.5%接種量，進(jìn)行廢棄白菜葉、青筍葉青貯發(fā)酵應(yīng)用試驗(yàn)，生產(chǎn)的尾菜青貯飼料品質(zhì)良好，顏色淡黃色或黃綠色，酸香味濃郁，質(zhì)地較松散，pH值＜4.0。研制的尾菜青貯菌劑適用于尾菜青貯。

尾菜；乳酸菌；青貯菌劑；制備；應(yīng)用

隨著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，蔬菜在收獲、凈菜加工、商品化處理與銷售環(huán)節(jié)，產(chǎn)生大量的尾菜。由于蔬菜產(chǎn)品具有較強(qiáng)的季節(jié)性，收獲和上市期短而集中，大量尾菜未被合理處理利用，而是當(dāng)作垃圾隨意堆放或者簡單填埋，使尾菜不僅被浪費(fèi)，而且造成了環(huán)境污染，給蔬菜產(chǎn)區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)民生活、農(nóng)村生態(tài)帶來了極大的負(fù)面影響[1-2]。尾菜中有機(jī)物和水分含量高，易腐爛變質(zhì)不宜貯存。為解決尾菜污染環(huán)境，實(shí)現(xiàn)尾菜資源化利用，對經(jīng)過分撿后無腐爛變質(zhì)的尾菜進(jìn)行青貯飼料制備，可以降低尾菜的營養(yǎng)物質(zhì)損失，較長期保存尾菜的青鮮狀態(tài)，提高尾菜青貯飼料的適口性、消化率和營養(yǎng)價(jià)值[3-6]。添加乳酸菌青貯，從青貯開始時(shí)，乳酸菌就成為優(yōu)勢菌群主導(dǎo)發(fā)酵進(jìn)程，可以快速產(chǎn)生乳酸，迅速降低pH值，從而抑制腐敗菌活動，加速青貯料發(fā)酵，減少營養(yǎng)成分損失，使尾菜中養(yǎng)分可以較好地保存，并使尾菜青貯飼料的品質(zhì)得到顯著改善。國外許多研究者對乳酸菌在青貯飼料制備中的作用和應(yīng)用進(jìn)行了大量深入的研究，而我國在青貯飼料乳酸菌添加劑方面的研究應(yīng)用還十分薄弱[7-13]。目前專門針對用于尾菜青貯的乳酸菌研究很少，自然青貯又不能保證尾菜青貯的品質(zhì)。

本研究利用5 L立瓶進(jìn)行尾菜青貯飼料發(fā)酵工藝研究，對選用的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD2、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD4的培養(yǎng)確定了最適收獲期和配比，并對制備的尾菜液體青貯菌進(jìn)行了應(yīng)用試驗(yàn)，目的是提高尾菜青貯飼料品質(zhì)，取得良好的青貯效果，為尾菜液體青貯菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。對防止尾菜造成環(huán)境污染，減少尾菜浪費(fèi)，實(shí)現(xiàn)尾菜資源化利用和促進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）SD2、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）SD4：甘肅省科學(xué)院生物研究所保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[14]：酪蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1L，pH 6.8。MC培養(yǎng)基[15]：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，CaCO310 g/L，瓊脂粉15 g/L，中性紅0.05 g/L，蒸餾水1 L，pH值6.0。

1.1.3尾菜

無腐爛變質(zhì)的廢棄白菜葉、青筍葉：蘭州定西南路菜市場。

1.1.4化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工廠。所用化學(xué)試劑均為分析純或生化試劑。

1.2儀器與設(shè)備

5 L立瓶：成都蜀玻集團(tuán)；DELTA 320 pH計(jì)：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）集團(tuán)公司；UV-120-02型分光光度計(jì)：日本島津公司；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；DG-1多功能培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械修造廠；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1液體青貯菌劑制備

將試管活化好的菌種，按5%（V/V）接種量接入500 mL三角瓶進(jìn)行種子液培，37℃培養(yǎng)12 h。將三角瓶種子液按體積比5%的接種量接入5 L立瓶，在37℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)pH＜5.5時(shí)用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵菌液pH至6.0～6.5。植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4在各自調(diào)控pH值培養(yǎng)的生長曲線達(dá)到最高值時(shí)，終止發(fā)酵。以未調(diào)控pH值的菌株培養(yǎng)為對照，通過鏡檢確定沒有雜菌，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定菌液活菌數(shù)＞1×109CFU/g，備用。

1.3.2生長曲線的測定

菌種活化擴(kuò)培后，以5%（V/V）接種量（菌種活菌數(shù)約為1×108CFU/mL）接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)32 h，分別于0、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h取樣，用分光光度計(jì)在波長600 nm條件下比色，測定菌液的吸光度值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.3活菌數(shù)測定

（1）發(fā)酵菌液活菌數(shù)測定

取1 mL待測定發(fā)酵菌液，用稀釋液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取10-6、10-7稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液置于MRS瓊脂平板上，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行，以滅菌的涂布器將菌懸液均勻涂開，然后將平板倒置于培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[16-17]。

（2）尾菜飼料乳酸菌總數(shù)測定

取5 g尾菜青貯飼料和45 mL無菌水混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-5、10-6稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液用涂布棒涂布于MC瓊脂平板上，培養(yǎng)48 h后，選擇菌落為紅色、周圍有明顯溶鈣環(huán)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（乳酸菌發(fā)酵糖產(chǎn)酸使菌落周圍碳酸鈣溶解，出現(xiàn)溶鈣環(huán)，中性紅為pH指示劑）。

1.3.4pH值測定

稱取尾菜青貯樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，使用組織搗碎機(jī)搗碎，然后用4層紗布紗布和濾紙分別進(jìn)行過濾，測定過濾液的pH值。

1.3.5營養(yǎng)成分檢測

粗蛋白測定采用國標(biāo)GB/T6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》；粗脂肪測定采用國標(biāo)GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定方法》；粗纖維測定采用國標(biāo)GB/T 6434—2006《飼料中粗纖維測定方法》。

1.3.6菌株配比確定

植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4的發(fā)酵液按活菌數(shù)比例1∶1、2∶1、1∶2進(jìn)行配比，按0.5%接種量接種到經(jīng)過預(yù)處理的廢棄白菜葉、青筍葉中，裝袋壓實(shí)封口，每組3平行。置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃條件下青貯發(fā)酵，分別于0～10 d每天取樣，測定各袋樣品中的pH值。

1.3.7青貯發(fā)酵試驗(yàn)

挑選無腐爛變質(zhì)的廢棄白菜葉、青筍葉進(jìn)行清洗，切割成長2 cm、寬3 cm，采用晾曬使廢棄白菜葉、青筍葉水分含量降至70%左右。將分別發(fā)酵好的植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4按一定比列混合，制備的尾菜液體青貯菌劑總活菌數(shù)＞1.0×109CFU/mL，尾菜液體青貯菌劑按照接種量0.5%，分別均勻噴灑到5 000 g青筍葉、5 000 g白菜葉中，裝入單向排氣閥青貯袋，裝袋后壓實(shí)、袋口密封，在30℃條件下發(fā)酵7 d，測定尾菜青貯飼料pH值及活菌數(shù)，綜合尾菜青貯飼料感官指標(biāo)，評價(jià)液體青貯菌劑的發(fā)酵性能。

2　結(jié)果與分析

2.1最適發(fā)酵時(shí)間的確定

乳酸桿菌在生長繁殖過程中分解代謝產(chǎn)生酸，隨著酸度的升高，pH值的下降，乳酸桿菌的生長受到抑制。為了促進(jìn)乳酸桿菌的生長和繁殖，植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4各自在5 L立瓶培養(yǎng)過程中，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制各自調(diào)節(jié)pH組和對照組的生長曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4調(diào)節(jié)pH組的乳酸菌數(shù)明顯高于對照組。植物乳桿菌SD2在24 h左右達(dá)到生長高峰期，之后趨于穩(wěn)定。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間24 h為植物乳桿菌SD2的最佳收獲期，此時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)1.8×109CFU/mL。發(fā)酵乳桿菌SD4在20 h左右達(dá)到生長高峰期，之后趨于穩(wěn)定。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間20 h為發(fā)酵乳桿菌SD2的最佳收獲期，此時(shí)發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)1.7×109CFU/mL。

圖1　植物乳桿菌SD2及發(fā)酵乳桿菌SD4生長曲線Fig.1　Growth curves ofL.plantarumSD2 andL.fermentumsSD4

2.2單菌與混菌青貯發(fā)酵

將植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4與SD2和SD4按活菌數(shù)1∶1混菌接種在預(yù)處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中，測定尾菜青貯飼料pH值，結(jié)果見圖2。

圖2　不同菌株青貯過程中pH變化Fig.2　pH changes of different strains in the process of silage

由圖2可知，SD2和SD4混菌發(fā)酵較單菌株發(fā)酵pH降低快，在5 d內(nèi)pH降低到4.0以下，單菌株SD2、SD4青貯發(fā)酵在7 d內(nèi)發(fā)酵pH降低到pH4.0以下。單菌與混菌青貯發(fā)酵7 d后pH值、乳酸菌活菌數(shù)及尾菜青貯飼料感官指標(biāo)，結(jié)果見表1。

表1　不同菌株青貯尾菜感官結(jié)果Table 1　Evaluation of vegetable wastes ensiled by different strains

由表1可知，菌株SD2、SD4發(fā)酵廢棄白菜葉、青筍葉7 d后，尾菜青貯飼料pH均低于4.0，乳酸菌數(shù)量大于1.0× 108CFU/g，顏色、氣味、質(zhì)地等感官指標(biāo)良好，適合用于尾菜青貯飼料的發(fā)酵。菌株SD2和SD4混菌青貯發(fā)酵pH降低較快，說明混菌發(fā)酵較單菌發(fā)酵更具優(yōu)勢。

2.3菌株配比確定

植物物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4的混菌發(fā)酵液按活菌數(shù)1∶1、2∶1、1∶2比進(jìn)行配比，按0.5%接種量接種到廢棄白菜葉、青筍葉中，30℃條件下青貯發(fā)酵，分別于0～10 d內(nèi)每天取樣，測定各袋樣品中的pH值，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4菌株間不同的配比，其pH值變化趨勢不同，產(chǎn)生了不同的發(fā)酵過程。在發(fā)酵初期，各處理的pH值相近，在發(fā)酵7 d后到pH變化均趨于穩(wěn)定。植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4配比為2∶1的青貯試驗(yàn)pH值最低，其pH值下降速率也最快，在4 d時(shí)pH值下降至4.0以下，7 d后下降緩慢，基本趨于穩(wěn)定。因此，當(dāng)植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4菌株活菌數(shù)的配比為2∶1時(shí)，充分發(fā)揮了其協(xié)同作用，能快速啟動發(fā)酵，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸使環(huán)境中的pH值迅速降低，最后穩(wěn)定在3.8左右，有利于尾菜青貯飼料的長期保存。

圖3　菌株不同配比青貯發(fā)酵過程中pH變化Fig.3　pH changes of different ratio of the strains in the process of silage fermentation

2.4青貯效果評定

植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4菌株活菌數(shù)的配比為2∶1，按0.5%接種量分別噴灑到廢棄白菜葉、青筍葉中。通過目測、嗅聞、手感感官檢驗(yàn)，pH值測定和活菌數(shù)計(jì)數(shù)，判斷青貯飼料發(fā)酵效果，結(jié)果見表2。廢棄白菜葉、青筍葉在青貯前后營養(yǎng)成分變化結(jié)果見表3。

表2　尾菜液體青貯菌劑發(fā)酵尾菜結(jié)果Table 2　Results of vegetable wastes fermented by liquid silage bacterial inoculants

由表2可知，制備的尾菜液體青貯劑接種廢棄白菜葉、廢棄青筍葉發(fā)酵7 d后發(fā)酵效果較好，pH值均＜4.0，達(dá)到了較長期保存尾菜的效果。其中青貯廢棄白菜葉顏色淡黃色，酸香味濃郁，質(zhì)地較松散、柔軟、不發(fā)粘，7 d后pH值為3.85，乳酸菌總數(shù)達(dá)到3.6×108CFU/g。青貯廢棄青筍葉，顏色黃綠色，酸香味濃郁，質(zhì)地松散、柔軟、不發(fā)粘，7 d后pH值為3.9，乳酸菌總數(shù)達(dá)到3.3×108CFU/g。使用制備的尾菜液體青貯劑對廢棄白菜葉、青筍葉進(jìn)行青貯發(fā)酵試驗(yàn)，進(jìn)一步證明植物乳桿菌SD2、發(fā)酵乳桿菌SD4共同作用青貯發(fā)酵效果良好（見表3）。

表3　尾菜青貯前后營養(yǎng)成分變化Table 3　Changes of nutrition components of vegetable wastes before and after the silage

由表3可知，尾菜青貯后粗蛋白和粗脂肪含量均有提高，粗纖維含量略有降低，從青貯后營養(yǎng)成分變化分析，使用制備的尾菜液體青貯劑提高了原尾菜營養(yǎng)性和可消化率。

3　結(jié)論

植物乳桿菌SD2在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，通過調(diào)控pH值，24 h左右活菌數(shù)達(dá)到最大值，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)1.8×109CFU/mL；發(fā)酵乳桿菌SD4在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，通過調(diào)控pH值，20 h左右活菌數(shù)達(dá)到最大值，發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)1.7×109CFU/mL。

植物乳桿菌SD2與發(fā)酵乳桿菌SD4活菌數(shù)配比2∶1，按質(zhì)量比0.5%接種量接種，30℃青貯尾菜在4 d時(shí)pH值下降至4.0以下，7 d基本趨于穩(wěn)定。制備的尾菜液體青貯菌劑發(fā)酵廢棄白菜葉、廢棄青筍葉，青貯效果良好，尾菜青貯飼料顏色淡黃色或黃綠色，酸香味濃郁，質(zhì)地較松散、柔軟、不發(fā)粘，尾菜青貯飼料pH值均＜4.0，達(dá)到了較長期保存尾菜的要求。

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Preparation and application of bacterial inoculants for vegetable wastes silage

SHAO Jianning,PENG Zhangpu,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,ZHAO Haoxing (Institute of Biology,Gansu Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

By the cultivation ofLactobacillus plantarumSD2 andLactobacillus fermentumSD4 in 5 L roller bottle,the bacterial inoculants for vegetable wastes silage were prepared.The results showed that in MRS liquid medium,at fermentation temperature 30℃,by adjusting pH value,the optimum harvesting time ofL.plantarumSD2 andL.fermentumSD4 were 24 h and 20 h,respectively.Under the condition ofL.plantarumSD2 and L.fermentumSD4 ratio 2∶1,the silage effect was the optimum,and the total viable count of bacterial inoculants for vegetable wastes silage was more than 1×109CFU/ml.The waste Chinese cabbage leaves and asparagus leaves were fermented by silage bacteria inoculants with inoculum 0.5%,and the vegetable wastes silage had good quality,light yellow or yellowish green color,strong acid fragrance and friable texture.The both vegetable wastes silage pHs were less than 4.0.The silage bacteria inoculants developed were suitable for the vegetable wastes silage.

vegetable waste;Lactobacillus;silage bacterial inoculants;preparation;application

Q939.97

0254-5071（2016）10-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.021

2016-08-11

蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-2-143）

邵建寧（1971-），男，高級工程師，本科，主要從事生物工程應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作。