張建新，穆廣亞，陳琳，李玲玲，聶國(guó)興*

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

類(lèi)芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的分離與純化

張建新，穆廣亞，陳琳，李玲玲，聶國(guó)興*

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillussp.）CH-3是一株高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株。本研究采用乙醇沉淀法、硫酸銨鹽析法、聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對(duì)CH-3菌株產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶進(jìn)行分離與純化，以選出純化率高且殘余酶活力高的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇沉淀法和硫酸銨鹽析法純化效果較差，聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系的純化效果較好，PEG濃度為20%（m/m）時(shí),上相測(cè)得的總酶活力最高，可以達(dá)到221 U/mL。在（NH4）2SO4濃度為18%（m/m）時(shí)，上相測(cè)得總酶活力最高，可以達(dá)到264 U/mL，同時(shí)酶萃取率達(dá)最大值為86.2%。因此，最優(yōu)的雙水相體系是20%（m/m）PEG和濃度為18%（m/m）（NH4）2SO4。

β-甘露聚糖酶；提取純化；雙水相體系

β-甘露聚糖酶（beta-mannanase）是一種可以專(zhuān)一性水解含β-1,4-甘露糖苷鍵的甘露多糖內(nèi)切水解酶，屬于半纖維素酶類(lèi)[1-2]。β-甘露聚糖酶在自然界中廣泛存在，由其水解產(chǎn)生的甘露寡糖在醫(yī)藥、功能性食品、保健領(lǐng)域表現(xiàn)出獨(dú)特的活性，已成為研究熱點(diǎn)[3]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甘露聚糖酶的研究主要集中在從環(huán)境中篩選產(chǎn)酶菌株[4-5]，對(duì)菌種進(jìn)行誘導(dǎo)育種[6]，優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶工藝[7-8]，將酶基因克隆在芽孢桿菌[9]、大腸桿菌[10-11]及畢赤酵母中異源表達(dá)[12]等方面。相關(guān)酶的分級(jí)提取方法國(guó)內(nèi)外報(bào)道的主要有孟玲等[13-14]的雙水相體系萃取方法，向冰冰[15]的硫酸銨鹽析方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)乙醇沉淀法、硫酸銨鹽析法、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對(duì)類(lèi)芽孢桿菌CH-3產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶進(jìn)行分離純化，得到最優(yōu)的純化方法，為該酶的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

菌株來(lái)源：本實(shí)驗(yàn)室從刺槐中分離得到已經(jīng)優(yōu)化并保存的類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillussp.）CH-3[3]。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、甘油、無(wú)水乙醇、酒石酸鈉、氫氧化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣、苯酚、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、無(wú)水亞硫酸鈉、硫酸銨等（均為分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇2000（分析純）：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：魔芋粉20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO40.3g/L，KCl 1 g/L，K2HPO41 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋粉20g/L，酵母膏10g/L，K2HPO42g/L，MgSO43 g/L，NaCl 1 g/L，（NH4）2HPO45 g/L，CaCl22 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 1 g/L，121℃高壓滅菌30 min。

1.2儀器與設(shè)備

ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHJH-C1112B型超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；Centrifuge5804R型低溫高速離心機(jī)：艾本德中國(guó)有限公司；XMTD-6000型恒溫水浴鍋：上虞市拓展儀器設(shè)備有限公司；Haier DW-86L 386超低溫冰箱：海爾電器集團(tuán)有限公司；BL150型電子天平：上海丙林電子科技有限公司；UV-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1粗酶液的制備

將-70℃甘油管保存的菌種使用LB固體培養(yǎng)基劃線，37℃倒置恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)入活化培養(yǎng)基，在37℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。按2%的接種量轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16 h。按2%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃、180 r/min搖床發(fā)酵72 h。將發(fā)酵液以5 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。

1.3.2乙醇沉淀

無(wú)水乙醇在冰箱中預(yù)冷至-20℃，加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的粗酶液中，分別調(diào)整乙醇用量為80mL/100 mL、100 mL/100 mL、150 mL/100 mL、200 mL/100 mL、300 mL/100 mL酶液，4℃靜置沉淀15 min，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用預(yù)冷乙醇洗滌2次，用磷酸緩沖液溶解沉淀，DNS法測(cè)酶活。

1.3.3硫酸銨鹽析

參考向冰冰[15]所用硫酸銨鹽析法，在離心管中裝入一定體積粗酶液，邊攪拌邊加入不同量干燥的固體硫酸銨，使混合體系中硫酸銨的飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃靜置過(guò)夜，10 000 r/min離心30 min，測(cè)混合體系中沉淀及上清液酶活力，繪制該粗酶液的鹽析曲線。

1.3.4雙水相萃取

參考孟玲等[13-14]采用雙水相萃取純化法，在22℃環(huán)境中，雙水相體系按照質(zhì)量來(lái)配制。向離心管內(nèi)依次加入酶液3 g，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%，PEG2000質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，用水補(bǔ)充至體系總質(zhì)量為10 g。以2 000 r/min離心8 min，溶液能夠分上、下相，讀取上相及下相體積，分別測(cè)上相和下相的蛋白含量和酶活力。雙水相萃取法處理后要經(jīng)過(guò)透析，冷凍后干燥處理并保存。

1.3.5測(cè)定方法

酶活測(cè)定：參照AKIN T等[17]方法。粗酶液與底物反應(yīng)生成的還原糖與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)，使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，即可計(jì)算出酶活。酶活性單位定義：每分鐘水解甘露糖生成1 μmol還原糖所需要的酶量定義為甘露糖酶活力單位（U/mL）。計(jì)算公式：

X=m×N/（M×a×b）

式中：X為酶活，U/mL，m為還原糖生成量，μg；N為樣品的稀釋倍數(shù)；M為樣品的物質(zhì)的量，g/mol；a為參與反應(yīng)的酶量，mL；b為反應(yīng)時(shí)間，min。

其他計(jì)算公式：

R=V上/V下

式中：R為相比；V上為上相體積，mL；V下為下相體積，mL。Ke=U上/U下

式中：Ke為β-甘露聚糖酶分配系數(shù)；U上為上相酶活，U/mL；U下為下相酶活，U/mL。

C（p）（C（e））=RKe/（1+RKe）

式中：Cp為總蛋白的萃取率，%；Ce為β-甘露聚糖酶的萃取率，%。

圖1　乙醇用量對(duì)上清與沉淀酶活的影響Fig.1　Effect of ethanol addition on enzyme activity of supernatant and precipitate

2　結(jié)果與分析

2.1乙醇沉淀

由圖1可知，當(dāng)無(wú)水乙醇用量為80～150 mL/100 mL酶液時(shí)，隨著乙醇用量增加，上清測(cè)得的酶活逐漸下降，沉淀測(cè)得的酶活呈上升趨勢(shì)。當(dāng)乙醇用量達(dá)到150 mL/100 mL酶液時(shí)，沉淀酶活出現(xiàn)下降趨勢(shì)?？傮w看來(lái)，在乙醇用量較小條件下上清測(cè)得的酶活較高，而沉淀酶活一直在較低水平波動(dòng)。用乙醇純化法，酶活損失較多，因此這種方法不適合用于該酶的分離純化。

2.2硫酸銨鹽析

由圖2可知，隨著硫酸銨飽和度的不斷增加，上清液酶活逐漸下降，在硫酸銨飽和度為90%時(shí)上清液中的酶基本完全失活。硫酸銨飽和度在50%～60%之間，上清酶活下降的最為迅速，且飽和度為20%～50%的上清液酶活損失少、離心效果好，沉淀物無(wú)酶活即沉淀物為雜蛋白。在其飽和度為50%～90%的離心管中出現(xiàn)絮狀蛋白漂浮物，沉淀蛋白不易收集，上清液測(cè)得酶活較低。如圖2所示，在硫酸銨的飽和度在20%～50%時(shí)沉淀酶活處于較低水平，當(dāng)硫酸銨飽和度＞50%時(shí)，沉淀中酶活迅速升高，在硫酸銨飽和度達(dá)到80%時(shí)，沉淀酶活達(dá)到最高73 U/mL。硫酸銨飽和度50%的體系中整體酶活較低，推測(cè)高濃度的硫酸銨可能使蛋白變性，使酶活降低。因此這種方法不適合用于該酶的分離純化。

圖2　硫酸銨飽和度對(duì)上清與沉淀酶活的影響Fig.2　Effect of(NH4)2SO4saturation on enzyme activity of supernatant and precipitate

2.3雙水相萃取

2.3.1PEG2000含量對(duì)酶分離的影響

雙水相體系中先固定（NH4）2SO4含量為16%，然后加入PEG2000在體系中達(dá)到的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)，離心分相后分別測(cè)其上相和下相的體積、酶活力及蛋白含量，結(jié)果如表1所示。

表1　PEG含量對(duì)酶分離的影響Table 1　Effect of PEG concentration on enzyme separation

由表1可知，PEG2000含量為14%～20%時(shí)，酶萃取率和蛋白萃取率均呈上升趨勢(shì)。PEG2000含量＞20%時(shí)酶萃取率開(kāi)始下降，而蛋白萃取率逐漸上升。原因可能是當(dāng)PEG2000含量較低時(shí)，（NH4）2SO4的鹽析作用在整個(gè)雙水相體系占主導(dǎo)作用，使離心管中酶主要分布在上相；隨著PEG含量不斷增加，體系中溶液的黏度增加，減少相間分子轉(zhuǎn)移的能力，相界面張力亦將增大。PEG2000含量為20%時(shí)，上相測(cè)得的總酶活力最高，可以達(dá)到221 U/mL，而且酶的萃取率也達(dá)到最高值81.4%。結(jié)果表明，PEG2000含量20%時(shí)萃取甘露聚糖酶效果最好。

2.3.2（NH4）2SO4含量對(duì)酶分離的影響

雙水相體系中先固定PEG含量為20%，然后加入硫酸銨在體系中達(dá)到不同濃度，離心分相后分別測(cè)其上相及下相的體積、酶活力及蛋白含量，結(jié)果如表2所示。

表2　硫酸銨含量對(duì)酶分離的影響Table 2　Effect of(NH4)2SO4concentration on enzyme separation

由表2可知，隨著（NH4）2SO4含量的逐漸增加，酶萃取率呈先上升后下降趨勢(shì)，但蛋白質(zhì)萃取率呈先下降后上升趨勢(shì)。在（NH4）2SO4含量為18%時(shí)，上相測(cè)得總酶活力最高，可以達(dá)到264 U/mL，同時(shí)酶萃取率達(dá)最大值86.2%，蛋白質(zhì)萃取率為53.2%，說(shuō)明（NH4）2SO4含量為18%時(shí)萃取蛋白多為酶蛋白，萃取效果最好，推測(cè)其原因可能是由于鹽濃度過(guò)大，破壞了體系中酶表面的水化層，從而造成酶萃取率和分配系數(shù)下降；雙水相系統(tǒng)兩相之間的電位差遭到破壞，改變體系中成相物質(zhì)的組成。結(jié)果表明，（NH4）2SO4含量18%時(shí)萃取甘露聚糖酶效果最好。

3　結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)大部分β-甘露聚糖酶以胞外誘導(dǎo)酶的形式存在于生物體中，目前對(duì)于胞外酶進(jìn)行的分離純化操作大多采用方法是將獲得的粗酶液先經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑沉淀或硫酸銨鹽析，然后通過(guò)凝膠層析、離子交換柱層析和親和層析等不同方法來(lái)進(jìn)一步處理[18-20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)β-甘露聚糖酶進(jìn)行乙醇沉淀法、硫酸銨沉淀法、聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系的分離純化研究。結(jié)果表明通過(guò)乙醇沉淀和硫酸銨鹽析不僅測(cè)得酶活較低，并且經(jīng)過(guò)高速離心后上清中出現(xiàn)少許絮狀物質(zhì)，經(jīng)酶活測(cè)定此絮狀物質(zhì)為酶蛋白，因此過(guò)程中酶活損失較多。導(dǎo)致這樣結(jié)果的原因可能是，在乙醇沉淀過(guò)程中，引起蛋白變性，從而降低酶活。而硫酸銨沉淀法的作用原理是蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中，通過(guò)增加其自身的疏水作用，使得蛋白質(zhì)趨于聚集，達(dá)到溶解極限，從而使蛋白沉淀析出的目的，在一定程度上也會(huì)使蛋白失活。聚乙二醇（PEG）/硫酸銨[（NH4）2SO4]雙水相體系對(duì)該酶的純化效果較好，體系中（NH4）2SO4含量18%、PEG2000含量20%效果最好，在此條件下，酶活力最高為264 U/mL，酶萃取率最大為86.2%。雙水相體系對(duì)于酶活影響相對(duì)較小，分析其原因可能是成相的聚乙二醇（PEG）是多羥基化合物，可以形成很多氫鍵，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的有效脫水，降低蛋白質(zhì)水解作用而起到穩(wěn)定酶的作用。雙水相體系中PEG濃度較高，黏度較大，上下相不宜分離，測(cè)定酶活時(shí)造成一定的酶損失，但雙水相處理去除了部分雜蛋白及雜質(zhì)，使酶保存較長(zhǎng)時(shí)間，為進(jìn)一步的精細(xì)分離奠定基礎(chǔ)。

[1]徐揚(yáng)，劉起麗，聶國(guó)興，等.β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（4）：34-37.

[2]張居作，李志波，徐君飛.產(chǎn)酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶活性研究[J].中國(guó)釀造，2014，33（11）：63-66.

[3]趙丹丹.產(chǎn)β-甘露聚糖酶內(nèi)生菌的篩選及酶學(xué)特性研究[D].新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2011.

[4]李長(zhǎng)影，孔雯，王家昕，等.甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的分離鑒定和酶學(xué)性質(zhì)[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（2）：138-142.

[5]張?jiān)乒?，韋玉琴，盧麗萍，等.產(chǎn)β-甘露聚糖酶的海洋微生物的篩選[J].廣西輕工業(yè)，2011，27（3）：3-5.

[6]李慧玲，劉祖艷，趙敏.瓜爾膠降解菌誘變及甘露聚糖酶特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（36）：14041-14043，14046.

[7]曲麗娜，王瑞明，肖靜，等.β-甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（12）：64-69.

[8]單修環(huán)，劉釔君，劉新利.產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，28（3）：28-32.

[9]劉項(xiàng)羽，徐美娟，楊套偉，等.β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢桿菌中的克隆及表達(dá)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2012，18（4）：672-677.

[10]GHOSH A,LUASA S,BRASJ L,et al.Thermostable recombinant β-mannanase fromC.thermocellum:Biochemical characterization and manno-oligosaccharides production[J].J Agr Food Chem,2013,61 (50):12333-12344.

[11]BAI X,HU H,CHEN H,et al.Expression of a β-mannosidase from Paenibacillus polymyxaA-8 inEscherichia coliand characterization of the recombinant enzyme[J].PLoS One,2014,9(11):e111622.

[12]唐衛(wèi)華，王瑞明，肖靜，等.β-甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J].生物技術(shù)，2013，23（2）：18-22.

[13]孟玲，楊丹，朱建星.雙水相體系萃取植物酯酶的研究[J].沈陽(yáng)化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2006（12）：254-257.

[14]周紅航，王維香.聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取豬胰蛋白酶[J].化學(xué)進(jìn)展，2009，28（2）：305-315.

[15]向冰冰.枯草芽孢桿菌WD 23β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生、純化及性質(zhì)研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2009.

[16]張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1997：140-142.

[17]AKINO T,SAKAMIA N,HORIKOSHI K.Characterization of three β-mannanases of anAlkaophilic baciussp.[J].Agr Biol Chem,1988, 52(3):773-779.

[18]楊基礎(chǔ)，沈忠耀，汪家鼎.用聚乙二醇/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中提取A-淀粉酶的研究[J].生物工程學(xué)報(bào)，1987，3（4）：273-280.

[19]張婕，趙敏.β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2011（2）：248-250.

[20]MARGA F,GHAKIS C,DUPONT C,et al.Improved production of mannanase byStreptomyces lividans[J].Appl Environ Microbiol, 1996,12:4656-4658.

Separation and purification ofβ-mannanase fromPaenibacillussp.

ZHANG Jianxin,MU Guangya,CHEN Lin,LI Lingling,NIE Guoxing*
(College of Fisheries,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

Paenibacillussp.CH-3 is a selective breeding bacterial strain ofβ-mannase with high yield.In order to choose the method with high purification rate and high residual enzyme activity，β-mannanase is purified by ammonium sulfate salting-out,ethanol precipitation and polyethylene glycol(PEG)/ammonium sulfate[(NH4)2SO4]aqueous two-phase systems.The result shows that ethanol precipitation method and ammonium sulfate salting-out method have poor purification effect,while polyethylene glycol/ammonium sulfate aqueous two-phase systems has better purification effect.When the PEG concentration is 20%(m/m),the total supernatant enzyme activity is the highest(221 U/mL).Meanwhile the extraction yield is up to 89.6%.When the[(NH4)2SO4]concentration is 18%(m/m),the total supernatant enzyme activity is the highest,the extraction yield is up to 86.2%.Therefore,the concentration of 20%(m/m)PEG and the concentration of 18%(m/m)(NH4)2SO4aqueous two-phase system could be the best.

β-mannanase;separation and purification;aqueous two-phase systems

TQ464

0254-5071（2016）10-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.015

2016-06-12

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)（132102310293，142102210453）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14B180023）；河南師范大學(xué)國(guó)家級(jí)科研項(xiàng)目培育基金（2013PL10）

張建新(1974-)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锩腹こ獭?/p>

聶國(guó)興（1971-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槊钢苿╅_(kāi)發(fā)與利用。