梁 征，熊思慧，郭 瑩，劉 剛，黃慶榮，何靜仁

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

紫米蛋白-多酚復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成及分子形貌

梁 征，熊思慧，郭 瑩，劉 剛，黃慶榮，何靜仁*

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

為研究紫米中蛋白-多酚復(fù)合物的分離純化及其結(jié)構(gòu)組成與分子形貌，采取Osborne分級提取從紫米中得到紫米蛋白-多酚復(fù)合物，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其分子質(zhì)量，鄰苯二甲醛柱后衍生法分析比較紫米蛋白-多酚復(fù)合物以及大米蛋白的氨基酸組成，高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析鑒定紫米蛋白-多酚復(fù)合物中花色苷聚合物的基本單體組成，并利用原子力顯微鏡觀察紫米蛋白-多酚復(fù)合物的表面形貌特征。結(jié)果表明，紫米蛋白-多酚復(fù)合物的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（94.3±2.7）%，多酚含量為（10.1±4.0） mg/g；紫米蛋白-多酚復(fù)合物與大米蛋白在37 ku以上分子質(zhì)量處亞基組成存在明顯差異；復(fù)合物的氨基酸組成更加豐富，有更優(yōu)的必需氨基酸組成；復(fù)合物中花色苷單體組成為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷；紫米蛋白-多酚復(fù)合物以不規(guī)則球形結(jié)構(gòu)為主，其結(jié)合單元的粒徑大約為4.7 nm左右。本實(shí)驗對后續(xù)探索有色谷物多酚復(fù)合物的功能特性、多酚-蛋白質(zhì)相互作用與生物活性等提供了科學(xué)依據(jù)。

紫米；蛋白-多酚復(fù)合物；結(jié)構(gòu)組成；分子形貌；原子力顯微鏡

紫米，又稱紫糯米，是一種天然“營養(yǎng)型”、“功能型”、“效益型”珍稀谷類[1-4]，是中國消費(fèi)量最大的功能稻米。紫米有滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、明目活血、抗癌和預(yù)防心臟病等作用[5-6]，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被用于增強(qiáng)腎功能、防治貧血、促進(jìn)血液循環(huán)、消除瘀血、防治糖尿病和改善視力。紫米防治慢性病功效顯著，主要?dú)w結(jié)于紫米種皮中富含花色苷、總黃酮、咖啡酸和阿魏酸等多酚類成分以及膳食纖維、維生素和甾醇類功能成分，使得紫米越來越受到人們的青睞。

紫米富含蛋白質(zhì)及花色苷類多酚物質(zhì)，目前關(guān)于紫米蛋白及其理化性質(zhì)研究的報道較少，特別是對其氨基酸組成、亞基組分及表面形貌的研究甚少。此外，有關(guān)紫米多酚類物質(zhì)的研究主要集中在紫米中花色苷類成分的提取[7]及其提取物的抗癌、消炎、抗糖尿病、降血脂等生物活性方面，對蛋白質(zhì)結(jié)合花色苷復(fù)合物的情況研究較少。紫米蛋白-多酚復(fù)合物作為一種天然的多酚與蛋白質(zhì)的聚合物，在蛋白-多酚復(fù)合物的分離純化中，多酚或花色苷聚合物與谷蛋白可能以共價鍵或非共價鍵的形式結(jié)合，因此本研究采取Osborne分級法提取紫米蛋白-花色苷類多酚復(fù)合物并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、鄰苯二甲醛（ortho phthalaldehyde，OPA）柱后衍生法分析、高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrum，HPLC-DAD-MS）聯(lián)用技術(shù)及原子力顯微鏡等研究紫米蛋白-多酚復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成以及分子形貌，為探索有色谷物蛋白多酚復(fù)合物的功能特性、多酚-蛋白相互作用及其對生物活性的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墨江紫米（Oryza sativa L.） 云南墨江紫歸牌；大米 市售（湖北產(chǎn)）；石油醚、乙醇（均為分析純） 天津科密歐公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）上海國藥化學(xué)試劑公司；甲酸、乙腈（均為色譜級）美國Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；STARER3100型電子pH計 美國Ohaus公司；YB-1000A型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)科技有限公司；TGL205型冷凍離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；ALPHA 2-4型冷凍干燥機(jī) 美國Christ公司；UDK 159型全自動微量凱氏定氮儀 意大利Velp Scientifica公司；垂直電泳儀、電泳成像設(shè)備 美國Bio-Rad公司；Accela LTQ XL HPLC-DAD-MS聯(lián)用儀（配有DAD、ESI離子源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國Thermo Fisher公司；原子力顯微鏡 美國Veeco Instruments公司。

1.3 方法

1.3.1 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的提取

1.3.1.1 紫米的預(yù)處理及脫脂

參考李亦蔚[2]的方法，將墨江紫米經(jīng)粉碎機(jī)磨成粉之后，過100 目篩。將紫米粉用石油醚超聲脫脂3 次，每次超聲30 min，直至石油醚呈無色透明為止。將脫脂后的紫米粉末置于通風(fēng)處放置12 h以除去殘余的石油醚。

1.3.1.2 Osborne分級法提取紫米蛋白-多酚復(fù)合物

取50 g脫脂紫米粉，加入500 mL蒸餾水，于室溫條件下攪拌提取2 h后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速室溫離心30 h。向離心所得到的沉淀物質(zhì)里加入500 mL 5% NaCl溶液，于室溫下攪拌提取2 h后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速室溫離心30 min。然后向離心所得到的沉淀物質(zhì)里加入500 mL 70%乙醇，于室溫條件下攪拌提取2 h后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速室溫離心30 min。對上述步驟離心所得到的沉淀物質(zhì)進(jìn)行水洗，直至沒有乙醇?xì)埩艉?，向其加?00 mL 0.05 mol/L NaOH溶液，于室溫條件下攪拌提取2 h后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速室溫離心30 min，合并離心所得的上清液，向上清液中加入0.05 mol/L鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH值至4.4。將上清液于室溫條件下4 000 r/min離心30 min，收集紫米蛋白多酚復(fù)合物沉淀。用蒸餾水沖洗紫米蛋白多酚復(fù)合物沉淀，然后將其置于透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 u）中透析1 d。收集得到的紫米蛋白-多酚復(fù)合物，置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍，冷凍干燥成粉末，待后續(xù)檢測。以上每次提取步驟重復(fù)2 次，并對大米進(jìn)行相同的處理得到大米蛋白[8-9]。

1.3.2 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的SDS-PAGE

紫米蛋白-多酚復(fù)合物的SDS-PAGE采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、pH 8.8的分離膠進(jìn)行分離。紫米蛋白-多酚復(fù)合物和大米蛋白溶解于0.1 mol/L NaOH溶液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 μg/μL，然后向其加入含有二硫蘇糖醇和溴酚藍(lán)指示劑的上樣緩沖液，沸水浴5 min使蛋白質(zhì)熱變性。蛋白質(zhì)的上樣量為10 μL。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為10～100 ku。電泳的具體步驟為：首先用60 V電壓電泳30 min，待指示劑條帶處于濃縮膠和分離膠的交界處，然后使用120 V電壓電泳，直至指示劑條帶處于膠的底端時停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，之后用洗脫液洗脫。洗脫完成后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。電泳的結(jié)果采用Quantity One 4.6.2版軟件進(jìn)行分析[10]。

1.3.3 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的基本成分測定

采用全自動微量凱式定氮儀測定。每次測定取樣品0.5 g，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)取5.85。紫米蛋白-多酚復(fù)合物中水分和灰分測定分別依照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》[11]和GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》[12]。

1.3.4 紫米蛋白-多酚復(fù)合物中總多酚含量的測定

紫米蛋白-多酚復(fù)合物中總多酚的提取方法[13]為：取2 g凍干后的紫米蛋白-多酚復(fù)合物，用60 mL 4 mol/L NaOH溶液在室溫條件下充氮?dú)鈹嚢? h，使其溶解充分。然后用6 mol/L鹽酸酸化至pH 1.5～2.5，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相后，過無水硫酸鈉除去水分后減壓干燥，用80%乙醇定容至10 mL。

紫米蛋白-多酚復(fù)合物中總多酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[13]：以沒食子酸作對照，在10 mL的容量瓶中加入5 mL去離子水，再加0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，最后加蒸餾水定容至10 mL，于室溫孵化2 h。在760 nm波長處測定對照品溶液的吸光度。

1.3.5 紫米蛋白-多酚復(fù)合物和大米蛋白中氨基酸含量的測定

參考劉婷[14]、趙晶晶[15]等的方法 ，采用OPA柱后衍生法測定。

前處理過程：稱量蛋白質(zhì)粉末0.25 g溶解于4 mL甲醇，振蕩30 min，放入-20℃的冰箱冷凍16 h。10 000 r/min離心20 min，取上清液3 mL，用氮?dú)獯蹈?，加? mL乙醇，振蕩30 min，放入-20 ℃的冰箱冷凍10 h。10 000 r/min離心20 min，取上清液3 mL以氮?dú)獯蹈珊髢龈?，加?00 μL蒸餾水，振蕩20 min，取出后10 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)過0.4 μm針頭過濾器后待測。

液相色譜條件：7725I手動進(jìn)樣器、Waters 680梯度控制器、Pickering柱后衍生系統(tǒng)、離子交換樹脂色譜柱（4.6 mm×150 mm）、Varian363熒光檢測器；流動相：A：0.2 mol/L Na315試劑（pH 3.0）、B：0.2 mol/L Na740試劑（pH 9.8）、流速：0.4 mL/min；柱溫：60 ℃；檢測波長：激發(fā)波長338 nm、發(fā)射波長425 nm；進(jìn)樣量：氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品2 μL、樣品4 μL；衍生劑：OPA。

式中：m1為紫米蛋白-多酚聚合體中氨基酸含量/（mg/g）；m2為雞蛋蛋白質(zhì)中氨基酸含量/（mg/g）。必需氨基酸指數(shù)的計算方法為：紫米蛋白-多酚復(fù)合物中含有的必需氨基酸與雞蛋蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量比值的幾何平均數(shù)。

1.3.6 HPLC-DAD-MS測定紫米蛋白-多酚復(fù)合物中花色苷單體組成

取0.5 g紫米蛋白-多酚復(fù)合物溶解于25 mL 0.2 mol/L的鹽酸溶液（pH 2.0）中，等體積乙酸乙酯振蕩萃取，重復(fù)3 次，合并水相并濃縮。將濃縮液過80～100 目聚酰胺樹脂，用70%乙醇洗脫花色苷。收集乙醇洗脫部分，減壓濃縮并定容至5 mL，HPLC-DAD-MS分析其花色苷組成[16]。

色譜柱為Thermo C18反相柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱溫箱溫度25 ℃，檢測器使用DAD，檢測波長530 nm，樣品進(jìn)樣量10 μL。流動相的總流速為150 μL/min，流動相A為0.3%甲酸溶液，流動相B為甲酸-乙腈-水（0.3∶30∶69.7，V/V）。梯度洗脫的方法如下：0 min，30%B；30 min，90%B；32 min，90%B；35 min，30%B。MS條件如下：采用ESI離子源，毛細(xì)管溫度270 ℃，毛細(xì)管電壓26 V，N2流速20 L/min，離子掃描范圍m/z 100～2 000 。整個過程采用正離子掃描模式[17-18]。

1.3.7 原子力顯微鏡觀察紫米蛋白-多酚復(fù)合物表面形貌紫米蛋白-多酚復(fù)合物的表面形貌觀察采用原子力顯微鏡的輕敲模式進(jìn)行測定[19]。干燥的紫米蛋白-多酚聚合物用0.1 mol/L的NaOH溶液充分溶解，其中紫米蛋白多酚聚合物的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。測試前，將20 μL樣品滴到硅片上，吸附30 s后，滴加1滴蒸餾水清洗硅片，用氮?dú)獯蹈?，反?fù)2 次。拍攝尺寸選擇2 μm×2 μm，使用Nanoscope 5.30分析軟件處理圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的組成分析

采用Osborne分級提取干燥后的紫米蛋白-多酚復(fù)合物，其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.5±0.1）%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（2.2±0.7）%。通過微量凱氏定氮法測得其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（94.3±2.7）%，F(xiàn)olin-Ciocalteu法測得其總酚含量為（10.1±4.0） mg/g。紫米蛋白-多酚復(fù)合物經(jīng)Osborne分級提取的得率為10.4%。

2.2 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的SDS-PAGE

圖1 紫米蛋白-多酚復(fù)合物與大米蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE of purple rice protein-polyphenol complexes and rice glutenin

在蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量范圍10～100 ku內(nèi)，用凝膠電泳分析軟件Quantity One對條帶分子質(zhì)量進(jìn)行分析，紫米蛋白-多酚復(fù)合物和大米蛋白有數(shù)條清晰的條帶（圖1）。首先，兩種蛋白質(zhì)均有分子質(zhì)量相近的3條條帶D、E、F。其中，D條帶分子質(zhì)量約為32～34 ku，E條帶分子質(zhì)量約為18～20 ku，F(xiàn)條帶分子質(zhì)量約為12～13 ku。這與Snow等[20]對大米蛋白多肽組成的研究相似：D條帶為酸性α亞基，E條帶為堿性β亞基，F(xiàn)條帶為少量的醇溶蛋白。兩種蛋白質(zhì)有分子質(zhì)量相似的亞基條帶，說明紫米蛋白-多酚聚合物與大米蛋白質(zhì)可能由相同的亞基組成。其次，紫米蛋白-多酚聚合物和大米蛋白在37 ku以上的分子質(zhì)量區(qū)域有不同的條帶分布：紫米蛋白-多酚聚合物有A、B、C 3條條帶，分子質(zhì)量分別為74～75、61～62、41～43 ku；而大米蛋白分子質(zhì)量在37 ku以上有G、H兩條條帶，分子質(zhì)量分別為62～64、39～40 ku。金融[21]、劉深勇[22]等的研究指出，大米蛋白亞基之間常由-S-S-裝配成分子質(zhì)量較大的高級結(jié)構(gòu)，兩種蛋白質(zhì)在37 ku以上的分子質(zhì)量區(qū)域條帶的出現(xiàn)，可能是因為兩個或多個亞基形成了復(fù)雜的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子質(zhì)量有不同程度的增大。紫米蛋白-多酚聚合物和大米蛋白在37 ku以上的分子質(zhì)量區(qū)域有不同的條帶分布，說明兩種蛋白高級結(jié)構(gòu)具有差異，這可能導(dǎo)致兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不同的功能性質(zhì)。

2.3 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的氨基酸組成分析

表1 紫米蛋白-多酚復(fù)合物和大米蛋白中17 種氨基酸含量Table 1 Contents of 17 amino acids in purple rice protein-polyphenol complexes and rice glutenin g/100 g

由表1可知，紫米蛋白-多酚復(fù)合物相對于普通大米蛋白，蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和精氨酸的含量均有所提高。蛋白中的第一限制氨基酸是賴氨酸，相比于大米蛋白，紫米蛋白-多酚復(fù)合物含有較多的賴氨酸。因此紫米蛋白-多酚復(fù)合物的氨基酸質(zhì)量更優(yōu)于普通的大米蛋白。

谷蛋白是大米主要蛋白質(zhì)組分，通常表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。蛋白質(zhì)的疏水性與蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中疏水性氨基酸的含量密切相關(guān)。由表1可知，紫米蛋白-多酚復(fù)合物組分中疏水性氨基酸質(zhì)量百分比較高，達(dá)（35.8±0.3）%，約占總氨基酸的1/3。因此紫米蛋白-多酚復(fù)合物具有較強(qiáng)的疏水性能。

表2 紫米蛋白-多酚復(fù)合物及大米蛋白的必需氨基酸組成Table 2 Essential amino acids of purple rice protein-polyphenol complexes and rice protein g/100 g

表3 紫米蛋白-多酚復(fù)合物及大米蛋白氨基酸評分和必需氨基酸指數(shù)Table 3 Amino acid score(ASS) and essential amino acid index (EAAI) of purple rice protein-polyphenol complexes and rice?protein %

朱智偉等[23]的研究表明，米色不同的稻米蛋白質(zhì)品質(zhì)差異較大，其中紫黑色米的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值最高。由表2可知，紫米蛋白-多酚復(fù)合物的必需氨基酸質(zhì)量百分比較高，占總氨基酸的（35.1±0.9）%。與FAO/WHO推薦的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)模式比較，紫米蛋白-多酚復(fù)合物的氨基酸組成中，除賴氨酸和異亮氨酸含量略有不足，亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、蘇氨酸含量明顯較高，纈氨酸含量相當(dāng)。而大米蛋白的必需氨基酸含量低于FAO/WHO推薦模式。必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid indexes，EAAI）衡量了蛋白質(zhì)的質(zhì)量和利用率。EAAI指數(shù)越高表示蛋白質(zhì)的質(zhì)量越優(yōu)質(zhì)[24]。由表3可知，相比于普通的大米蛋白，紫米蛋白-多酚復(fù)合物的必需氨基酸指數(shù)的評分較高，具有更高的營養(yǎng)價值。

2.4 紫米蛋白-多酚復(fù)合物中花色苷組成分析

圖2 紫米蛋白-多酚復(fù)合物中花色苷HPLC圖Fig. 2 HPLC results for anthocyanins in purple rice protein-polyphenol complexes

紫米蛋白-多酚復(fù)合物中花色苷組成的HPLC分析結(jié)果（圖2）表明，在530 nm波長處兩個主要吸收峰，峰1和峰2的保留時間分別為13.62 min和17.92 min。HPLC-DAD-MS進(jìn)一步分析鑒定其結(jié)構(gòu)。如圖3所示，峰1的一級質(zhì)譜有449（[M+H]+）的特征離子峰，這與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的分子質(zhì)量吻合。該化合物的二級質(zhì)譜圖（圖4）進(jìn)一步表明，峰1特征離子峰在二級質(zhì)譜中有287（[M+H-162]+）的特征碎片，這是矢車菊素單體失去一個葡萄糖分子（相對分子質(zhì)量162）的特征離子峰[18]。因此紫米蛋白-多酚復(fù)合物中峰1為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（圖6）。峰2的一級質(zhì)譜如圖5所示，MS圖中出現(xiàn)了463（[M+H]+）的特征離子峰，這與芍藥素-3-O-葡萄糖苷的分子質(zhì)量吻合，該化合物含量較低，二級質(zhì)譜中沒有出現(xiàn)明顯碎片離子，進(jìn)一步與黑米花色苷的有關(guān)文獻(xiàn)[9,25]比較分析，推斷該離子峰為芍藥素-3-O-葡萄糖苷（圖6）。

圖3 峰1的一級質(zhì)譜圖Fig. 3 Full mass spectrum of peak 1

圖4 峰1的二級質(zhì)譜圖Fig. 4 Secondary mass spectrum of peak 1

圖5 峰2的一級質(zhì)譜圖Fig. 5 Full scan mass spectrum of peak 2

圖6 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)式Fig. 6 Structure of cyanidin-3-O-glucoside and peonidin-3-O-glucoside

2.5 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的表面形貌

圖7 紫米蛋白-多酚復(fù)合物（0.1 mg/mL）的原子力顯微鏡成像結(jié)果Fig. 7 Tapping mode atomic force microscopy (AFM) images of purple rice protein-polyphenol complexes at concentration of 0.1 mg/mL

圖80 .1 mg/mL紫米蛋白-多酚復(fù)合物原子力顯微鏡高度圖選擇分析Fig. 8 Sectional analysis of AMF height image of protein particles formed by 0.1 mg/mL purple rice protein-polyphenol complexes

原子力顯微鏡是表征蛋白質(zhì)表面形貌特征的常用手段。在緩沖液體系中，常使用原子力顯微鏡的輕敲模式分析樣品。本實(shí)驗對質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的紫米蛋白-多酚復(fù)合物在輕敲模式下進(jìn)行原子力顯微鏡成像分析，得到高度圖和相圖（圖7）。結(jié)果表明：紫米蛋白-多酚復(fù)合物分子呈現(xiàn)較為不規(guī)則的球形，可能是蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與多酚之間以及蛋白質(zhì)-多酚-蛋白質(zhì)之間的多種聚合作用[26-27]產(chǎn)生。圖8顯示了紫米蛋白-多酚復(fù)合物在0.1 mg/mL下的測量尺寸，其中垂直距離指蛋白顆粒從頂端到底部的尺寸，通常反映蛋白顆粒在干燥狀態(tài)下的粒徑。如圖8所示，0.1 mg/mL紫米蛋白-多酚復(fù)合物的垂直距離約為4.7 nm。

3 結(jié) 論

采用Osborne分級制備紫米蛋白-多酚復(fù)合物，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（94.3±2.7）%，多酚含量為（10.1±4.0） mg/g。SDS-PAGE分析表明，紫米蛋白-多酚復(fù)合物與大米蛋白在12～34 ku范圍內(nèi)有相同的3條亞基條帶，但在37 ku以上分子質(zhì)量處亞基組成存在明顯差異。OPA柱后衍生法分析了紫米蛋白-多酚復(fù)合物和大米蛋白質(zhì)的氨基酸組成，結(jié)果表明前者的氨基酸組成更加豐富，與FAO/WHO模式相比具有更優(yōu)的必需氨基酸組成。HPLC-DAD-MS分析鑒定了紫米蛋白-多酚復(fù)合物中花色苷的單體組成，主要為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和芍藥素-3-O-葡萄糖苷。原子力顯微鏡觀察了紫米蛋白-多酚復(fù)合物的分子形貌，在0.1 mg/mL質(zhì)量濃度下蛋白粒徑大約為4.7 nm，以不規(guī)則球形結(jié)構(gòu)為主。通過實(shí)驗得出紫米蛋白-多酚復(fù)合物的主要成分為紫米谷蛋白-花色苷復(fù)合物，紫米谷蛋白-花色苷復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成及形貌的初步研究為后續(xù)探索有色谷物蛋白多酚復(fù)合物的功能特性、多酚-蛋白相互作用與生物活性及高蛋白、高花色苷含量紫米功能食品開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

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Structural Composition and Molecular Morphology of Purple Rice Protein-Polyphenol Complexes

LIANG Zheng, XIONG Sihui, GUO Ying, LIU Gang, HUANG Qingrong, HE Jingren*
(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The present study investigated the separation and purification of purple rice protein-polyphenol complexes as well as their structural composition and molecular morphology. Purple rice protein-polyphenol complexes were separated from purple rice by Osborne sequential extraction. It was found that the purity of purple rice protein was (94.3 ± 2.7)%, and the content of polyphenol was (10.1 ± 4.0) mg/g. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis results indicated that purple rice protein-polyphenol complexes were significantly different from rice glutenin in terms of subunits with molecular weight over 37 ku. The amino acid composition of protein-polyphenol complexes was richer than that of rice glutenin as analyzed by post-column derivatization with ortho phthalaldehyde, with superiority observed in essential amino acid composition according to the FAO/WHO model. The monomeric anthocyanins in purple rice protein-polyphenol complexes, identified by high performance liquid chromatography with diode array detector-mass spectrum, was cynidin-3-O-glucoside and paeonidin-3-O-glucoside. Atomic force microscope showed that the surface topography of purple rice protein-polyphenol complexes was irregularly spherical with particle size of 4.7 nm. This study can provide the scientific basis for further studies on functional and biological characteristics of colored rice.

purple rice; protein-polyphenol complexes; structural composition; molecular morphology; atomic force microscope

10.7506/spkx1002-6630-201621015

Q946.1

A

1002-6630（2016）21-0085-06

梁征, 熊思慧, 郭瑩, 等. 紫米蛋白-多酚復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成及分子形貌[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 85-90. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621015. http://www.spkx.net.cn

LIANG Zheng, XIONG Sihui, GUO Ying, et al. Structural composition and molecular morphology of purple rice proteinpolyphenol complexes[J]. Food Science, 2016, 37(21): 85-90. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621015. http://www.spkx.net.cn

2016-01-04

湖北省自然科學(xué)基金項目（2014CFB891）；湖北省科技支撐計劃項目（2015BHE015；2015BBA167）；武漢市青年科技晨光計劃項目（2014072704011258）

梁征（1991—），男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工化學(xué)與食品營養(yǎng)。E-mail：m13419524142@163.com

*通信作者：何靜仁（1974—），男，教授，博士，研究方向為膳食功效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子營養(yǎng)。E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn