楊勇，丁洪波，唐建，王健美

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610000；2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川成都610000）

不同凍存溫度及時(shí)間對人血漿蛋白分離沉淀中蛋白質(zhì)的影響

楊勇1，2，丁洪波2，唐建2，王健美1

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都610000；2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川成都610000）

《中國藥典》2015年版中規(guī)定了蛋白沉淀應(yīng)凍存于-30℃以下，并規(guī)定其有效期；但此處的規(guī)定僅針對“最終凍存溫度”或“低溫保存設(shè)備的設(shè)定溫度”，并未對沉淀凍存降溫過程、時(shí)間進(jìn)行規(guī)定。但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，對沉淀凍存時(shí)間、溫度的統(tǒng)計(jì)過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅴ、FⅡ沉淀凍存過程的實(shí)際降溫時(shí)間可能長短不同，在極端的情況下，可能超過48h的降溫時(shí)間范圍規(guī)定。為考察此種情況，開展了對凍存沉淀質(zhì)量的影響試驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)Ⅴ、FⅡ沉淀對較高凍存溫度（-10℃）的最長耐受時(shí)間均大于為72h。

人血漿蛋白沉淀；凍存溫度；凍存最長耐受時(shí)間

根據(jù)《中國藥典》2015年版三部，對于蛋白沉淀的凍存溫度，在“人血白蛋白”項(xiàng)目下，規(guī)定“2.1.4組分Ⅴ沉淀應(yīng)凍存于-30℃以下，并規(guī)定其有效期”；在“靜注人免疫球蛋白(pH4)”項(xiàng)目下，規(guī)定“2.1.3組分Ⅱ、組分Ⅱ+Ⅲ沉淀或組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀應(yīng)凍存于-30℃以下，并規(guī)定其有效期”；在“乙型肝炎人免疫球蛋白”“破傷風(fēng)人免疫球蛋白”等條目下，藥典也作出了相同規(guī)定?！吨袊幍洹?015年版三部僅規(guī)定了蛋白沉淀的“最終凍存溫度”或“低溫保存設(shè)備的設(shè)定溫度”，并未對沉淀凍存降溫過程、時(shí)間，或者可能發(fā)生的溫度波動(dòng)或回升進(jìn)行規(guī)定[1]，故此項(xiàng)補(bǔ)充驗(yàn)證試驗(yàn)將根據(jù)公司實(shí)際使用的低溫保存設(shè)備和實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)行情況對蛋白沉淀的凍存過程做更加詳細(xì)深入的研究。

1　試驗(yàn)材料

MDF-U5412低溫保存箱為日本三洋公司生產(chǎn)，可用于各種組織、細(xì)胞、微生物、血液制品和DNA樣本的冷凍保存，是當(dāng)今高端生物制藥領(lǐng)域普遍使用的先進(jìn)低溫保存設(shè)備。三洋MDF-U5412低溫保存箱用于組份FⅤ、FⅡ沉淀的冷凍保存，制冷溫度最低可達(dá)-40℃，完全滿足《中國藥典》2015年版三部關(guān)于蛋白沉淀凍存溫度的規(guī)定。

2　試驗(yàn)準(zhǔn)備

根據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)際生產(chǎn)過程數(shù)據(jù)，F(xiàn)Ⅴ、FⅡ沉淀在收集完畢后，經(jīng)檢測沉淀的溫度大概在-5℃左右，放入溫度已經(jīng)達(dá)到-35℃的三洋MDF-U5421低溫保存箱后，低溫保存箱顯示溫度會升至-10℃左右，由于實(shí)驗(yàn)取得的10g左右的小樣品，在放置進(jìn)入低溫保存箱后即立即進(jìn)行熱交換并迅速達(dá)到目標(biāo)溫度，在現(xiàn)有條件下無法對小樣品模擬進(jìn)行降溫曲線的擬合[2]。故選取-10℃作為實(shí)際生產(chǎn)過程中凍存條件可能的最高溫度，作為沉淀較高凍存溫度下耐受性的最差溫度條件，最低溫度則設(shè)為-35℃。

3　試驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1監(jiān)測FⅡ沉淀溶解液純度和分子大小分布、FⅤ沉淀溶解液純度和多聚體含量

經(jīng)日常檢查，監(jiān)測運(yùn)行平穩(wěn)，無故障。分別隨機(jī)抽取3個(gè)批次的FⅡ和FⅤ沉淀樣品，批號為M201503055、M201503056、M201503057。每批次組分樣品各12份，每份10±2g。沉淀樣品分別凍存于-10℃和-35℃條件下，將2種凍存溫度下的沉淀在不同的存儲時(shí)間（0、48、72h)后取出，進(jìn)行外觀檢查確認(rèn)后，對每一份加水至7倍沉淀質(zhì)量的體積70±14mL充分?jǐn)嚢枞芙鈁3]，取2mL樣品保存在2～8℃環(huán)境中待檢。樣品對應(yīng)-10℃條件下不同時(shí)間編號為A0、A48、A72，樣品對應(yīng)-35℃條件下不同時(shí)間編號為B0、B48、B72。 FⅤ沉淀和FⅡ沉淀的質(zhì)量指標(biāo)為外觀、純度、多聚體含量及分子大小分布。對FⅡ沉淀溶解液純度和分子大小分布、FⅤ沉淀溶解液純度和多聚體含量進(jìn)行檢測，試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別見圖1和圖2。

圖1　試驗(yàn)抽樣的3個(gè)批次FⅡ沉淀溶解液純度及分子大小分布

圖2　試驗(yàn)抽樣的3個(gè)批次的FⅤ沉淀溶解液純度及多聚體含量

由圖1和圖2可知，對于可接受標(biāo)準(zhǔn)，相較于在-35℃凍存的沉淀，在-10℃凍存的FⅤ或FⅡ沉淀外觀一致，無明顯色差；該凍存時(shí)間內(nèi)的各批次間FⅤ或FⅡ沉淀溶解液純度、多聚體含量及分子大小分布檢測數(shù)據(jù)經(jīng)T檢驗(yàn)在α=0.05水平上無顯著性影響（P＞0.05）。則可以認(rèn)為在該保存時(shí)間內(nèi)，-10℃凍存溫度條件的FⅤ或FⅡ沉淀質(zhì)量屬性無明顯變化。即說明在-10℃凍存條件下，F(xiàn)Ⅴ或FⅡ沉淀可以耐受該保存時(shí)間的凍存。

3.2蛋白沉淀對較高凍存溫度的最長耐受時(shí)間

基于本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的FⅤ和FⅡ蛋白沉淀在-10℃凍存條件下，質(zhì)量屬性是否發(fā)生顯著變化的最長時(shí)間（72h），作為蛋白沉淀對較高凍存溫度（-10℃）是否耐受的最長耐受時(shí)間。

3.2.1凍存時(shí)間對蛋白品質(zhì)影響

以B0為基準(zhǔn)，B48列下的T檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)為-35℃凍存48h蛋白質(zhì)量數(shù)據(jù)，B72列下的T檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)為-35℃凍存72h蛋白質(zhì)量數(shù)據(jù)。所有B72列T檢驗(yàn)P值均大于0.05（見圖3），說明在95%置信度下，在-35℃下，凍存72h后的蛋白（FⅡ和FⅤ2種）的純度、多聚體含量及分子大小分布與沉淀新制?。˙0）時(shí)無顯著性差異。

另外，所有B48列T檢驗(yàn)P值均大于0.05（見圖3），說明在95%置信度下，在-35℃下，凍存48h后的蛋白（FⅡ和FⅤ2種）的純度、多聚體含量及分子大小分布與沉淀新制?。˙0）時(shí)無顯著性差異；此結(jié)論符合藥典要求與我們的預(yù)期，從一定程度上證明了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

以上試驗(yàn)部分證明，在規(guī)定凍存溫度下（-35℃），較長的凍存時(shí)間（72h）對球蛋白或白蛋白的品質(zhì)無顯著影響。

3.2.2凍存溫度對蛋白品質(zhì)影響

在FⅤ或FⅡ沉淀存放48h/72h，存放溫度為-10℃/-35℃的條件下，以B48、B72為基準(zhǔn)，所有B48和B72列T檢驗(yàn)P值均大于0.05（見圖3），說明在95%置信度下，在-10℃/-35℃存放48h/72h下的FⅡ和FⅤ蛋白的純度、多聚體含量及分子大小分布在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著影響。

3.2.3極端情況討論

以A0為基準(zhǔn)，做了極端情況試驗(yàn)，即在-10℃下將2種蛋白凍存72h，其質(zhì)量數(shù)據(jù)檢測結(jié)果與T檢驗(yàn)值位于A72列下。所有A72列T檢驗(yàn)P值均大于0.05（見圖3），說明在95%置信度下，在-10℃下，凍存72h后的蛋白（FⅡ和FⅤ2種）的純度、多聚體含量及分子大小分布與沉淀新制?。ˋ0）無顯著性差異。

以上部分試驗(yàn)證明較長凍存時(shí)間（72h）和較高凍存溫度（-10℃）同時(shí)作用時(shí)，對無論球蛋白或白蛋白的品質(zhì)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著影響。

圖3　T檢驗(yàn)P值

4　結(jié)論

較于在-35℃凍存的沉淀，在-10℃凍存的FⅤ、FⅡ沉淀外觀一致，無明顯色差；該凍存時(shí)間內(nèi)的各批次間FⅤ、FⅡ沉淀溶解液純度、多聚體含量及分子大小分布檢測數(shù)據(jù)經(jīng)T檢驗(yàn)在α＝0.05水平上無顯著性影響（P＞0.05），則可以認(rèn)為在該保存時(shí)間內(nèi)，-10℃凍存溫度條件的FⅤ、FⅡ沉淀質(zhì)量屬性無明顯變化；即說明在-10℃凍存條件下，F(xiàn)Ⅴ、FⅡ沉淀可以耐受該保存時(shí)間的凍存，符合預(yù)期要求，試驗(yàn)結(jié)果符合要求。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，F(xiàn)Ⅴ、FⅡ沉淀對較高凍存溫度（-10℃）的最長耐受時(shí)間均大于為72h。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）[EB/OL].(2015-01-19)[2016-07-15].http://www.doc88.com/ p-6631812004183.html.

[3]汪世華.蛋白質(zhì)工程[M].北京:科學(xué)出版社,2008:29-30.

Effect of Protein in Precipitation from Human Plasma Protein with Different Frozen Storage Temperature and Time

Yang Yong1，2,Ding Hong-bo2,Tang Jian2,Wang Jian-mei1
(1.School of Life Science,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610000; 2.Chengdu Rong Sheng Pharmaceutical Co. Ltd.,Sichuan Chengdu 610000)

Chinese Pharmacopoeia 2015 provides protein precipitation should be frozen at - 30℃,and the provisions of the period of validity; But the provisions only provide "final freezing temperature",or "cold storage equipment set temperature",did not set up about the precipitation of the frozen storage cooling process or time. Because there are differences in the refrigeration capacity of the low temperature storage bins or cold storage,although the set of frozen storage temperature is same,and the cooling time is long enough to reach and stabilize the temperature of the target. But in the actual production process,in the statistical process of freezing time and temperature of the precipitation,found that the actual cooling time of FⅤand FⅡprecipitation freezing process may be different,it may be more than 48 hours of cooling time range. In order to investigate this kind of situation,the experiment on the effect of the quality of the frozen precipitation was carried out. The results showed that the longest tolerance time of the FⅤand FⅡof high temperature frozen precipitation deposit (-10 ℃) were 72 hours.

Precipitation from human plasma protein; Frozen storage temperature; Frozen maximum tolerance time

R341

A

2096-0387（2016）05-0015-03

楊勇（1983-），四川成都人，碩士研究生，研究方向：生命科學(xué)。