白文薈，陳愛亮

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,北京 100081)

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適配體傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

白文薈，陳愛亮*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,北京 100081)

基于脫氧核糖核酸的生物檢測技術(shù)在食品中有毒有害物質(zhì)檢測方面發(fā)揮著日益重要的作用。其中，作為一類具有良好應(yīng)用前景的分析工具，以適配體技術(shù)為基礎(chǔ)的快速檢測方法與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有簡單便攜、響應(yīng)迅速、靈敏度高、特異性好、成本低等顯著優(yōu)勢(shì)，因此在近些年成為分析檢測領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。該文總結(jié)了近幾年應(yīng)用于食品安全特別是農(nóng)藥殘留檢測的幾種適配體檢測技術(shù)(包括比色法、熒光法以及電化學(xué)法)，并對(duì)其檢測特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了介紹。

適配體；農(nóng)藥殘留；檢測；綜述

目前，我國的食品安全形勢(shì)不容樂觀，相當(dāng)一部分農(nóng)畜產(chǎn)品中的有毒有害物質(zhì)殘留超標(biāo)，重金屬、水污染及農(nóng)藥污染嚴(yán)重。這不僅影響了人民群眾的身體健康和生命安全，也極大程度地影響到我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在施藥后，農(nóng)藥在農(nóng)作物、蔬果、土壤、大氣、環(huán)境水中長期殘留，不僅會(huì)造成環(huán)境污染等問題，還會(huì)經(jīng)由食物鏈的富集作用，最終進(jìn)入人體，對(duì)人體健康造成極大危害，除急慢性中毒外，“三致”作用、誘發(fā)癌癥等也是農(nóng)藥殘留不可忽視的潛在危害。目前使用的農(nóng)藥種類主要包括有機(jī)磷類、有機(jī)氮類、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。其中有機(jī)磷農(nóng)藥屬于高毒性農(nóng)藥，也是我國目前在用殺蟲劑的主要種類[1-2]，其主要的危害機(jī)理是能夠抑制動(dòng)物體內(nèi)的膽堿酯酶活性，尤其是抑制乙酰膽堿酯酶，從而引起神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的累積，造成神經(jīng)功能的紊亂[3-4]。有機(jī)氮類農(nóng)藥包括氨基甲酸酯類、脒類、酰胺類等多種含氮有機(jī)化合物，并以氨基甲酸酯類農(nóng)藥的使用最為廣泛，此類農(nóng)藥在環(huán)境中較易分解，大多數(shù)屬于低毒性農(nóng)藥，但仍具有一定程度的慢性毒性[5]，其毒性機(jī)理與有機(jī)磷農(nóng)藥相似，但對(duì)膽堿酯酶抑制作用的時(shí)間較短[6]。脒類農(nóng)藥(如啶蟲脒)的主要毒性則為神經(jīng)毒性，急性中毒主要損傷心血管系統(tǒng)，慢性中毒會(huì)造成神經(jīng)衰弱、誘發(fā)癌癥等[7]。

1 農(nóng)藥殘留檢測研究現(xiàn)狀

目前農(nóng)藥殘留檢測常用的方法主要有傳統(tǒng)的儀器檢測法以及酶抑制法、免疫分析法、生物傳感器法等快速檢測方法。

1.1 常規(guī)儀器檢測法

利用精密的大型儀器如質(zhì)譜或色譜等檢測農(nóng)藥殘留，仍是目前農(nóng)藥殘留的主要定量檢測方法。薄層色譜 (Thin layer chromatography,TLC)法是色譜法中應(yīng)用最早、最為廣泛的一種微量檢測方法，檢出限可達(dá)0.1～0.01 μg[4]。近年來，薄層色譜法與酶抑制法、熒光顯色技術(shù)等結(jié)合能檢測顯色法無法或不易檢出的某些農(nóng)藥，并且大大提高了某些農(nóng)藥的檢出限[8]。氣相色譜(Gas chromatography,GC)法可一次測定多種成分，具有選擇性好、效能高、靈敏、快速、應(yīng)用廣、樣品用量少、儀器造價(jià)低、能同時(shí)分離分析多組分混合物、易于自動(dòng)化等特點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留定量分析中的應(yīng)用最為廣泛[9]。選擇合適的檢測器類型是應(yīng)用GC有效測定農(nóng)藥殘留的關(guān)鍵，主要用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的兩種檢測器類型是火焰檢測器(Flame photometric detector,FPD)[6-12]和氮磷檢測器(Nitrogen and phosphorus detector,NPD)[9-15]。與經(jīng)典液相色譜相比，高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)法的分離效率高，分離速度快，靈敏度高，同時(shí)可以測定高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、易裂解變質(zhì)等不宜用氣相色譜法測定的相對(duì)分子量較大的化合物[16-17]。但高效液相色譜法有機(jī)溶劑用量大、前處理過程復(fù)雜的缺點(diǎn)不可忽視。質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)法在多殘留定性定量分析檢測中具有顯著優(yōu)勢(shì)，常與色譜法聯(lián)用，如GC-MS[18-22]，GC-MS/MS[23]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[24-26]的應(yīng)用，均進(jìn)一步推動(dòng)了農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的發(fā)展。

1.2 常見快速檢測法

傳統(tǒng)的儀器檢測方法普遍存在前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、檢測成本高、需專業(yè)人員等不足，無法滿足快速篩查及普及應(yīng)用的需要。目前常見的農(nóng)藥殘留快速檢測方法主要包括酶抑制法、免疫分析法和生物傳感器法等。

酶抑制法是應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥快速檢測方法[27-29]，該方法簡便、靈敏、成本低，十分適合現(xiàn)場快速檢測和批量樣品篩查檢測。其主要原理是基于有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE，Acetylcholinesterase)催化水解功能的抑制作用，且抑制程度與有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。目前市面上常見的農(nóng)藥速測卡大多基于酶抑制法的檢測原理。

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA，Enzyme linked immunosorbent assay)是一種基于抗原抗體特異性識(shí)別和結(jié)合反應(yīng)的分析技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高(檢出限可達(dá)1 μg～1 pg)、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)[30]。近年來，國內(nèi)外已研究開發(fā)出殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等40余種農(nóng)藥的酶免疫分析方法[31]，且用于田間快速測定的酶免疫分析試劑盒也已商品化。

生物傳感器是一類特殊的化學(xué)傳感器，由生物識(shí)別元件(如酶、微生物、抗體等)和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所組成，生物部分產(chǎn)生的信號(hào)可轉(zhuǎn)換為光、電、聲等信號(hào)而被檢測，對(duì)靶標(biāo)具有高度選擇性，可在復(fù)雜體系中進(jìn)行在線、快速、連續(xù)監(jiān)測[32]。應(yīng)用于農(nóng)藥檢測的傳感器主要有基于酶抑制原理的膽堿酯酶傳感器以及基于水解原理的有機(jī)磷水解酶傳感器，隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來，光導(dǎo)纖維、壓電晶體、半導(dǎo)體器件型生物傳感器也相繼出現(xiàn)，為農(nóng)藥檢測提供了新途徑[4]。

近幾年也不斷涌現(xiàn)其他快速檢測方法，如分子印跡技術(shù)(MIT，Molecular imprinting technology)、噬菌體展示技術(shù)(PDT，Phage display technology)等，引起了廣泛關(guān)注。應(yīng)用 MIT 制備的分子印跡聚合物(MIPs，Molecularly imprinted polymers)具有特定識(shí)別性、化學(xué)穩(wěn)定性和廣泛適用性等優(yōu)點(diǎn)[33-35]。采用分子印跡膜(MIM，Molecularly imprinted)代替已有的傳感器識(shí)別元件，提高了傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性，且價(jià)格低。Bakas等[33]基于分子印跡技術(shù)建立了樂果的分子印跡固相萃取方法，成功用于橄欖油中樂果的分離提取，之后采用高效液相色譜法檢測，靈敏度可達(dá)0.012 μg/g。此后，該課題組利用分子印跡固相萃取方法成功分離提取了橄欖油中的倍硫磷[34]，與傳統(tǒng)的C18提取柱相比分離效率顯著提升，結(jié)合高效液相色譜檢測，檢出限可達(dá)5 μg/L。Duan等[35]結(jié)合分子印跡技術(shù)建立了乙酰甲胺磷的電化學(xué)檢測方法，檢出限可達(dá)0.13 μmol/L。噬菌體展示技術(shù)則是在噬菌體表面將外源蛋白基因與噬菌體表面特定蛋白融合，用于改造和篩選功能性多肽的生物技術(shù)，具有結(jié)合特性強(qiáng)、易于篩選等特點(diǎn)[36]，但由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，一些對(duì)細(xì)胞有毒性的分子很難得到表達(dá)和展示。目前只有Jiang等[36]利用噬菌體展示技術(shù)針對(duì)二甲基類的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了相應(yīng)抗體制備的研究，并成功建立了非競爭性的免疫檢測體系，方法檢出限可達(dá)10.54 μg/L。

2 適配體技術(shù)在農(nóng)藥快速檢測中的應(yīng)用

近幾年，基于脫氧核糖核酸(DNA)的生物檢測方法研究也在持續(xù)升溫，應(yīng)用領(lǐng)域逐漸涉及分子診斷[37-40]、藥物基因組學(xué)[41-42]、藥物篩查[43-45]、食品分析[46]、農(nóng)藥及環(huán)境污染物監(jiān)測[47-49]等。核酸適配體是指可與待測靶標(biāo)特異性結(jié)合的單鏈寡聚核苷酸鏈。適配體具有篩選簡單、靶標(biāo)物質(zhì)范圍廣、親和性與特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)和易修飾等優(yōu)點(diǎn)，與目前應(yīng)用更為廣泛的抗體、酶等生物傳感元件相比，制備難度更低、生物穩(wěn)定性更優(yōu)、生物依賴性更小，在快速分析檢測領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。隨著近幾年適配體技術(shù)的不斷發(fā)展，在農(nóng)藥殘留分析檢測方面，已成功篩選或設(shè)計(jì)了若干條對(duì)幾種特定農(nóng)藥具有高度親和性與特異性的適配體核酸序列，并在此基礎(chǔ)上成功建立了包括比色法、熒光法、電化學(xué)法在內(nèi)的農(nóng)藥殘留快速檢測方法(見表1)，進(jìn)一步推動(dòng)了食品安全快速檢測技術(shù)的發(fā)展。

表1 農(nóng)藥適配體的應(yīng)用

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2.1 比色法

一直以來，基于納米材料(例如納米金、納米銀等)的比色法作為一類靈敏直觀的檢測手段，因其檢測原理簡單且無需特別的專業(yè)操作技術(shù)，通過納米顆粒的團(tuán)聚所表現(xiàn)出的體系顏色變化即可直觀便捷地實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的快速檢測，因此在分析領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛。目前，比色法已成功應(yīng)用于多種類型目標(biāo)物的檢測分析，包括核酸[62]、蛋白質(zhì)[63]以及金屬離子[64]等小分子量靶標(biāo)[65]，基于光譜法原理的適配體傳感器在農(nóng)藥殘留檢測方面的研究也有不少進(jìn)展。

Pang等[51]通過將巰基化的適配體偶聯(lián)在納米銀顆粒表面借助表面增強(qiáng)拉曼光譜平臺(tái)(SERS，Surface enhanced Raman spectroscopy)實(shí)現(xiàn)了4種有機(jī)磷農(nóng)藥的同時(shí)檢測。該方法的檢測原理如圖1A所示：首先，將特異性適配體通過巰基作用偶聯(lián)于納米銀顆粒表面，形成Ag-Apt；然后，向該混合體系中加入6巰基乙醇(MH)避免非特異性結(jié)合，混合孵育后形成[Ag-(Apt+MH)]復(fù)合物，該復(fù)合物結(jié)構(gòu)能夠特異性捕獲磷酸基團(tuán)(P)；最后加入待測目標(biāo)物，混合孵育后離心去除上清液獲得[Ag-(Apt+MH)-P]結(jié)構(gòu)復(fù)合物，重溶蒸發(fā)干燥后即可用于光譜檢測。該方法中4種有機(jī)磷農(nóng)藥靶標(biāo)水胺硫磷、氧樂果、甲拌磷、丙溴磷的檢出限分別可達(dá)1，5，0.1，5 μg/mL，并成功應(yīng)用于蘋果汁樣品的檢測。方法中的適配體可以特異性地捕捉4種有機(jī)磷農(nóng)藥，文中也提出了利用特定適配體檢測更廣范圍的有機(jī)磷農(nóng)藥的想法。本課題組在此基礎(chǔ)上，首次建立了基于適配體納米金比色技術(shù)的6種有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測技術(shù)[52]。首先單鏈DNA適配體可吸附于納米金顆粒表面，保護(hù)其在高鹽濃度溶液下仍保持紅色，且不發(fā)生團(tuán)聚；向表面吸附著適配體的納米金溶液中加入相應(yīng)的靶標(biāo)后，對(duì)適配體具有高親和力的靶標(biāo)與納米金顆粒競爭性結(jié)合適配體，形成適配體-靶標(biāo)復(fù)合結(jié)構(gòu)，使起保護(hù)作用的適配體從納米金粒子表面解離；再向反應(yīng)體系中加入一定濃度的鹽溶液后，可使失去保護(hù)的納米金顆粒在鹽離子作用下團(tuán)聚，溶液變?yōu)樽仙蛩{(lán)色，并且納米金溶液的變色程度與靶標(biāo)濃度呈正相關(guān)。利用該方法檢測水胺硫磷的檢出限可達(dá)0.1 μg/mL，而伏殺硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、敵百蟲、毒死蜱5種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限則為2 μg/mL，并成功應(yīng)用于河水樣品的檢測。雖然方法的靈敏度有待提高，但與現(xiàn)有最常用的儀器檢測方法相比省去了復(fù)雜的樣品前處理過程以及對(duì)人員和技術(shù)的嚴(yán)苛要求；與Pang等[51]的拉曼光譜檢測法相比，本課題組建立的檢測方法體系更為簡單，操作更為便捷。Liu等[53]根據(jù)靶標(biāo)滅蠅胺的結(jié)構(gòu)特性設(shè)計(jì)了一段高親和性適配體(polyT10)，建立了一種高靈敏度的基于polyT10和納米金的比色法檢測滅蠅胺，檢測原理見圖1B：自由卷曲的單鏈polyT10可以吸附在納米

金上保護(hù)其在鹽存在時(shí)不團(tuán)聚變色，而當(dāng)加入靶標(biāo)滅蠅胺時(shí)，polyT10與其通過氫鍵結(jié)合導(dǎo)致其從納米金表面解離，失去了保護(hù)的納米金在鹽存在時(shí)變藍(lán)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)滅蠅胺的檢測。該方法的LOD和LOQ分別為252 ng/g和500 ng/g，符合我國對(duì)滅蠅胺在蔬菜中的最大殘留限量要求(MRLs)，并在黃瓜中得到成功應(yīng)用。Shi等[55]利用啶蟲脒的高親和力適配體建立了納米金比色法(圖1C)，線性范圍為75 nmol/L～7.5 μmol/L，最低檢出限可達(dá)5 nmol/L，并在土壤樣品中成功應(yīng)用。特別指出的是，該條啶蟲脒適配體的特異性非常好，即使加入啶蟲脒的結(jié)構(gòu)類似物吡蟲啉和毒死蜱，該方法仍表現(xiàn)出極好的特異性。Kwon等[56]成功篩選出異稻瘟凈和克瘟散的高親和力適配體，并建立了基于適配體納米金比色原理(圖1D)的多重靶標(biāo)檢測體系，實(shí)現(xiàn)大米樣品中異稻瘟凈和克瘟散的高靈敏檢測，檢出限分別為1.67 μmol/L和38 nmol/L。

2.2 熒光法

熒光分析法是以熒光探針與生物大分子結(jié)合后的熒光特性、電化學(xué)特征、動(dòng)力學(xué)特征等為基礎(chǔ)而建立的一類檢測方法，其測定機(jī)理是待檢分子對(duì)探針分子熒光強(qiáng)度的影響。與其他光學(xué)檢測技術(shù)相比，熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好等突出優(yōu)點(diǎn)；且具有多種測定參數(shù)，如熒光壽命、熒光量子產(chǎn)率等；多種檢測技術(shù)，如同步熒光、共振熒光、熒光動(dòng)力學(xué)分析法等[66]。隨著熒光技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光分析不再局限于一些強(qiáng)熒光物質(zhì)的分析，還可以利用“熒光探針”技術(shù)即某些試劑與非熒光或弱熒光物質(zhì)以共價(jià)或其他形式結(jié)合形成發(fā)熒光的絡(luò)合物或聚集體進(jìn)行測定，對(duì)無熒光或弱熒光的物質(zhì)進(jìn)行分析[66]。近幾年，與適配體相結(jié)合的熒光分析技術(shù)得到了很大發(fā)展。

Zhang等[57]利用分子信標(biāo)(Molecular beacon，MB)和適配體建立了一種有機(jī)磷農(nóng)藥的熒光檢測方法，并對(duì)甘藍(lán)樣品進(jìn)行了加標(biāo)檢測。該方法的檢測原理(圖2A)：具有特定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)和靶標(biāo)物質(zhì)對(duì)特定的適配體序列存在競爭性結(jié)合，這種MB在其發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩端分別標(biāo)記有1個(gè)熒光基團(tuán)和1個(gè)熒光猝滅基團(tuán)，單獨(dú)存在時(shí)處于熒光猝滅狀態(tài)；當(dāng)體系中加入適配體后，二者的互補(bǔ)序列即可發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，原本相鄰的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)因空間距離的增加使得熒光信號(hào)釋放，此時(shí)可檢測到較強(qiáng)的熒光信號(hào)；在加入靶標(biāo)時(shí)，與靶標(biāo)具有高度親和力的適配體會(huì)部分從MB-適配體復(fù)合結(jié)構(gòu)上發(fā)生解離，從而使部分MB恢復(fù)可使熒光猝滅的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時(shí)體系可檢測到的熒光信號(hào)與之前相比有所降低，且降低程度與加入靶標(biāo)的濃度呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的定量分析。利用該方法檢測甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧樂果的檢出限分別為19.2，13.4，17.2，23.4 nmol/L，與Pang等[51]建立的這4種有機(jī)磷農(nóng)藥的光譜檢測法相比靈敏度有了很大程度的提高，說明熒光檢測法具有更加靈敏的優(yōu)勢(shì)。Dou等[58]利用納米金構(gòu)建了一個(gè)檢測原理類似的納米探針，利用相似的原理(圖2B)檢測了上述4種有機(jī)磷農(nóng)藥，該方法檢測甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧樂果的檢出限分別為0.384，0.134，0.035，2.35 μmol/L，雖然檢測的靈敏度不及MB，但在有效降低背景干擾方面優(yōu)勢(shì)顯著。Tang等[59]首次將可以特異性識(shí)別4種有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜適配體與量子點(diǎn)技術(shù)結(jié)合，基于毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)技術(shù)建立了4種有機(jī)磷農(nóng)藥的高靈敏檢測方法，檢測原理如圖2C所示：首先，羧基修飾的量子點(diǎn)(QD)可與適配體的互補(bǔ)序列(AMO)末端的氨基以酰胺鍵形成QD-AMO結(jié)構(gòu)，無待測靶標(biāo)存在時(shí)，該結(jié)構(gòu)可與適配體進(jìn)一步結(jié)合形成線性的帶有部分雙鏈的復(fù)合物；加入靶標(biāo)后，適配體與靶標(biāo)以更高親和力結(jié)合，QD-AMO-Apt復(fù)合物雙鏈結(jié)構(gòu)解離，導(dǎo)致之前的線性結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，變?yōu)閮煞N復(fù)合結(jié)構(gòu)QD-AMO和適配體-靶標(biāo)復(fù)合物。隨著靶標(biāo)濃度的變化，QD-AMO和QD-AMO-Apt的熒光峰高比會(huì)發(fā)生規(guī)律性的變化，變化的結(jié)果可利用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(CE-LIF)技術(shù)進(jìn)行檢測，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的定量分析。利用該方法檢測蘋果皮中甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧樂果的檢出限分別為0.20，0.10，0.17，0.23 μmol/L。Lin等[60]用經(jīng)ZnS∶Mn量子點(diǎn)修飾的啶蟲脒適配體，結(jié)合納米金和多壁碳納米管(MWCNTs)建立了一種熒光檢測方法(圖2D)：首先，將經(jīng)過量子點(diǎn)修飾的適配體固定在納米金顆粒上，該方法中使用的MWCNTs具有猝滅量子點(diǎn)熒光的作用，在體系中只有納米金-適配體和MWCNTs存在的情況下，熒光被猝滅，能檢測到的熒光信號(hào)大幅度下降；加入啶蟲脒后，納米金-適配體復(fù)合物會(huì)與靶標(biāo)特異性結(jié)合，從而使體系熒光得以恢復(fù)，并且恢復(fù)的程度與靶標(biāo)濃度呈正相關(guān)。該方法對(duì)啶蟲脒的檢測線性范圍為0～150 nmol/L，檢出限可達(dá)0.7 nmol/L，并在河水和菜葉等實(shí)際樣品中驗(yàn)證了方法的有效性。

2.3 電化學(xué)法

圖3 檢測啶蟲脒的電化學(xué)傳感器的構(gòu)建和原理示意圖[61]Fig.3 Schematic of a highly selective electrochemical impedance spectroscopy-based aptasensor for sensitive detection of acetamiprid[61]

電化學(xué)適配體傳感器作為一類極具發(fā)展?jié)摿Φ姆治龉ぞ?，因具有便攜性好、響應(yīng)迅速、靈敏度高、特異性好以及檢測成本低等優(yōu)點(diǎn)，在近幾年的食品安全檢測領(lǐng)域的研究中時(shí)有報(bào)道。在預(yù)先經(jīng)過表面功能活化的電極表面固定化修飾針對(duì)特定靶標(biāo)的核酸適配體，表面功能化策略的選擇會(huì)直接關(guān)系到電化學(xué)傳感器的活化區(qū)域面積，進(jìn)而影響適配體固定化的效果，因此，固定化策略應(yīng)盡可能降低位阻現(xiàn)象的影響[67]。目前適配體結(jié)合電化學(xué)技術(shù)檢測農(nóng)藥的文獻(xiàn)報(bào)道僅Fan等[61]針對(duì)啶蟲脒建立了基于電化學(xué)阻抗譜分析(EIS)的電化學(xué)檢測方法。其基本原理(圖3)：首先，將納米金粒子通過電沉積作用修飾在裸金電極表面，這層納米金顆粒一方面可作為后續(xù)固定適配體的載體，另一方面還可提高適配體的靈敏度；然后，將巰基化的啶蟲脒適配體通過與納米金粒子的偶聯(lián)作用固定在電極上的納米金顆粒層，即完成電化學(xué)傳感器的構(gòu)建。當(dāng)加入啶蟲脒時(shí)，啶蟲脒-適配體復(fù)合物的形成會(huì)引起電子轉(zhuǎn)化電阻的增加，且增加的程度與靶標(biāo)濃度正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)啶蟲脒的高靈敏、高特異性檢測。該方法經(jīng)過污水和番茄實(shí)際樣品的驗(yàn)證，檢出限可達(dá)1 nmol/L，線性范圍為5～600 nmol/L。針對(duì)其他農(nóng)藥的電化學(xué)適配體傳感器尚處在研究階段，未見有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

3 結(jié)論與展望

與很多獸藥都有ELISA試劑盒或試紙條不同，農(nóng)藥的種類數(shù)量眾多，且大部分農(nóng)藥的分子量較小，難以制備抗體，所以基于免疫分析的農(nóng)藥快速檢測方法及產(chǎn)品非常少。雖然有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥可用酶抑制法達(dá)到快速檢測目的，但由于膽堿酯酶活性不穩(wěn)定，造成該方法的精密度及準(zhǔn)確度無法滿足實(shí)際應(yīng)用，因此面對(duì)數(shù)量眾多的農(nóng)藥殘留亟待開發(fā)一種新的快速檢測方法。

適配體作為一類新型分子識(shí)別元件，具有與抗體類似的親和力與特異性，但相對(duì)于抗體的動(dòng)物體內(nèi)制備，適配體是在體外篩選獲得，因此適用于任何靶標(biāo)，為篩選眾多農(nóng)藥的特異性識(shí)別元件提供了解決方法。同時(shí)基于適配體的檢測技術(shù)也比傳統(tǒng)的免疫比色法更具優(yōu)勢(shì)，首先其核酸性質(zhì)使其可以利用雜交、擴(kuò)增以及特異核酸酶等開發(fā)各種超靈敏的檢測方法，另外適配體和靶標(biāo)結(jié)合前后其構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，利用這一性質(zhì)可開發(fā)出多種turn-on或turn-off的無需洗滌等步驟的均相檢測方法。這種簡單、快速、靈敏的優(yōu)勢(shì)使得適配體分析技術(shù)日益受到重視，在構(gòu)建新型生物傳感器的研究中愈加發(fā)揮著重要的作用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

適配體雖然已在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域有所應(yīng)用，但還有很多技術(shù)難點(diǎn)需要克服。首先，目前已篩選到的親和性及特異性均經(jīng)過驗(yàn)證的有效適配體數(shù)量太少，檢測方法開發(fā)的局限性較大，需進(jìn)一步加強(qiáng)農(nóng)藥適配體的篩選工作，或者從改造現(xiàn)有的適配體入手，如片段化或者尋找核心序列等，又或者根據(jù)靶標(biāo)性質(zhì)自行設(shè)計(jì)適配體[49]，從而獲得更多特異性及親和力更好的農(nóng)藥適配體；其次，目前建立的快速檢測方法存在靈敏度待提高、體系穩(wěn)定性待增強(qiáng)以及基質(zhì)干擾影響較大等問題，需進(jìn)一步優(yōu)化檢測體系及基質(zhì)樣品的前處理方法；最后，亟需開發(fā)新的更穩(wěn)定和更實(shí)用的基于適配體的快速檢測方法，比如目前在食品安全快速檢測領(lǐng)域廣受青睞的試紙條技術(shù)，將其簡便、快速、實(shí)用的特點(diǎn)與適配體技術(shù)結(jié)合，有望成為將來農(nóng)藥殘留速測的發(fā)展方向?？傊诖罅哭r(nóng)藥難以制備抗體而缺乏快速檢測方法的情況下，基于適配體的快速分析技術(shù)為農(nóng)藥殘留快速檢測方法的研發(fā)提供了新思路，相信在不久的將來，基于適配體技術(shù)的分析檢測方法會(huì)在農(nóng)藥檢測領(lǐng)域占據(jù)更加重要的位置。

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Applications of Aptasensor in Determination for Pesticide Residues

BAI Wen-hui,CHEN Ai-liang*

(Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

DNA based biosensors have become increasingly important in hazardous and toxic substances detection.Particularly,the aptamer-based methods have been intensively investigated as potential analytical tools providing desired portability,fast response,high sensitivity and specificity in addition to lower cost against classical methods.Some of the techniques for detection of aptasensors(including colorimetric,fluorescent and electrochemical assays) in the last few years were summarized,and their detection characters and applications were discussed.

aptamer；pesticide；residues；detection；review

2016-04-19；

2016-06-22

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助(201203023)

綜 述

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.026

O657；F767.2

A

1004-4957(2016)10-1360-09

*通訊作者：陳愛亮，博士，副研究員，研究方向：食品安全快速檢測技術(shù),Tel：010-82106557，E-mail：ailiang.chen@gmail.com