江本利，蘇香峰，儲(chǔ)甲松，路曦結(jié)

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，安徽合肥 230031)

?

蜜環(huán)菌培養(yǎng)影響因子的多因素分析

江本利，蘇香峰，儲(chǔ)甲松，路曦結(jié)

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，安徽合肥 230031)

[目的]探討蜜環(huán)菌人工培養(yǎng)方法。[方法]研究菌材營(yíng)養(yǎng)和pH、光照、溫度等環(huán)境條件下蜜環(huán)菌生長(zhǎng)形態(tài)變化規(guī)律和生長(zhǎng)量。[結(jié)果]pH 5.0浸泡液浸泡菌材、黑暗條件有利于蜜環(huán)菌生長(zhǎng)；溫度較高有利于氣生菌絲生長(zhǎng)，溫度較低有利于菌索生長(zhǎng)；用帶有櫟樹(shù)、棉秸稈的混合材料作菌材培養(yǎng)蜜環(huán)菌，可實(shí)現(xiàn)發(fā)菌快、菌索多的目的。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為提高蜜環(huán)菌人工培養(yǎng)技術(shù)水平提供了理論依據(jù)。

蜜環(huán)菌；生長(zhǎng)形態(tài)；生長(zhǎng)量

蜜環(huán)菌是一種腐生、寄生兼性營(yíng)養(yǎng)真菌，屬于層菌綱傘菌目口蘑科蜜環(huán)菌屬。其生物形態(tài)呈現(xiàn)復(fù)雜多樣性，既有白絮狀氣生菌絲，又有紫紅色根狀菌索。蜜環(huán)菌具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，與天麻、豬苓是共生關(guān)系[1-2]。在天麻栽培生產(chǎn)中，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)與天麻產(chǎn)量呈正相關(guān)[3]；同樣，豬苓菌核在其生長(zhǎng)過(guò)程中不能完全自養(yǎng)，需要吸收蜜環(huán)菌菌索的代謝產(chǎn)物才能繼續(xù)生長(zhǎng)[4]。另外，該類(lèi)真菌本身具有藥用、食用價(jià)值，科研工作者已開(kāi)發(fā)出與蜜環(huán)菌有關(guān)的藥品和保健品，如蜜環(huán)菌糖漿、蜜環(huán)菌浸膏、蜜環(huán)菌片、健腦露、蜜環(huán)菌酒和蜜環(huán)菌飲料等[5]。這些產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)促進(jìn)了蜜環(huán)菌資源需求，為了擴(kuò)展菌材種類(lèi)和來(lái)源，進(jìn)一步完善人工培養(yǎng)蜜環(huán)菌技術(shù)，筆者在前人工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)將櫟樹(shù)、白楊的枝材和棉秸稈莖段粉碎成屑(過(guò)1 cm孔徑)培養(yǎng)蜜環(huán)菌，分析了不同條件下蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的形態(tài)變化規(guī)律和生長(zhǎng)量變化情況，研究了蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的適應(yīng)特性。

1 材料與方法

1.1 材料 菌材：櫟樹(shù)(青岡櫟)枝材，采自安徽省安慶市岳西縣石關(guān)鄉(xiāng)黃羊村；楊樹(shù)(意大利楊)枝材，采自安徽省安慶市迎江區(qū)龍獅鄉(xiāng)前進(jìn)村；棉秸稈(陸地棉)，采自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所安慶試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)；菌種：蜜環(huán)菌種京-234，由陜西省洋縣天麻研究所提供。液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL。

1.2 培養(yǎng)方法 將蜜環(huán)菌母種接入液體培養(yǎng)基，22 ℃、150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)10 d，達(dá)到菌絲球直徑2.5 mm、菌液紫色時(shí)取用。分別取各種菌材碎屑(過(guò)1 cm孔徑篩)，烘干至恒重；用200 mL玻璃瓶裝料，每瓶裝入20.0 g木屑、30 mL固定pH的浸泡液(純水+稀硫酸調(diào)成)，蓋緊瓶蓋，121 ℃高壓滅菌2 h，冷卻后接入5 mL液體菌種，放入三面透明培養(yǎng)箱，設(shè)定溫度培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)菌材、浸泡液pH(以下簡(jiǎn)稱(chēng)pH)、光照、溫度4個(gè)因子，其中菌材設(shè)4個(gè)水平，即櫟樹(shù)(標(biāo)記為L(zhǎng))、楊樹(shù)(Y)、棉秸稈(M)、三者1∶1∶1混合的材料(以下稱(chēng)為混材，H)；pH設(shè)3個(gè)水平，即5.0、6.0、7.0，分別標(biāo)記為5、6、7；光照設(shè)2個(gè)水平，即室內(nèi)自然光照(G)、完全黑暗(A)；溫度設(shè)3個(gè)水平，即16、20、24 ℃，分別標(biāo)記為1、2、3。單個(gè)處理編號(hào)為4個(gè)因素標(biāo)記的組合，例如L5G1表示該處理為在櫟樹(shù)菌材、pH 5、室內(nèi)自然光照、16 ℃條件下培養(yǎng)蜜環(huán)菌，其他依此類(lèi)推；數(shù)據(jù)處理表格中表示某個(gè)因子(組合)處理，用_代替其他因子水平，該因子(組合)符號(hào)不變，如L___表示菌材因子為櫟樹(shù)的所有處理，L_G_表示櫟樹(shù)菌材和室內(nèi)自然光照條件下的所有處理，其他依此類(lèi)推。采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共72個(gè)處理，3次重復(fù)，合計(jì)216瓶。

1.4 調(diào)查方法 觀察蜜環(huán)菌生長(zhǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化，記錄培養(yǎng)45 d后各種形態(tài)長(zhǎng)勢(shì)的強(qiáng)弱并進(jìn)行比較；記錄培養(yǎng)瓶接種完畢初始質(zhì)量及培養(yǎng)45 d后質(zhì)量，以各因子水平下培養(yǎng)瓶的質(zhì)量變化量為考察對(duì)象分析蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，通過(guò)方差分析檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性，利用LSR法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌材營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境條件下蜜環(huán)菌生物學(xué)形態(tài)變化與比較 觀察發(fā)現(xiàn)，蜜環(huán)菌在菌料上的生長(zhǎng)大致分為4個(gè)階段：①氣生菌絲侵入菌料，白色菌絲生長(zhǎng)擴(kuò)展一定區(qū)域并累積成白絮狀，菌絲分泌黏液，菌料和大量白色菌絲開(kāi)始黏結(jié)成塊；②菌料結(jié)塊觸到培養(yǎng)瓶的玻璃壁擴(kuò)張受阻，從外看瓶壁上形成了以菌液漬痕為外緣的白色菌斑，氣生菌絲從內(nèi)伸出繼續(xù)侵入菌料；③菌斑內(nèi)逐漸形成白色菌索，部分白色菌索初期呈扁平帶狀；④白色菌索從菌料結(jié)塊突出，成為紅色根狀菌索，尖端保持白色，以菌索形式侵入菌料。

蜜環(huán)菌生長(zhǎng)情況如上所述，但各因素水平下生長(zhǎng)進(jìn)度及生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱有差異。在菌材營(yíng)養(yǎng)方面(表1)，以櫟樹(shù)為菌材，蜜環(huán)菌較易進(jìn)入以菌索形態(tài)為主的生長(zhǎng)階段，菌絲生長(zhǎng)較少；以楊樹(shù)為菌材，菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌斑、菌索形成也較少；以棉秸稈為菌材，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，多數(shù)經(jīng)過(guò)白色菌斑的累積生長(zhǎng)后才進(jìn)入白色菌索生長(zhǎng)階段，45 d紅色根狀菌索剛開(kāi)始生長(zhǎng)；以混材為菌材，與棉秸稈相似，但白色菌索較少，紅色根狀菌索稍多。在環(huán)境因素方面(表2)，浸泡液pH 5.0條件下，紅色菌索形成較多；完全黑暗條件下蜜環(huán)菌生長(zhǎng)勢(shì)較室內(nèi)自然光照條件下強(qiáng)；24 ℃條件下白色菌斑、白色菌索較20、16 ℃條件下多，但紅色菌索量無(wú)優(yōu)勢(shì)。

表1 不同營(yíng)養(yǎng)因素下蜜環(huán)菌生長(zhǎng)形態(tài)比較

Table 1 The growth morphology comparison ofArmillariamelleaunder different nutritional factors

蜜環(huán)菌形態(tài)MorphologyofArmillariamellea櫟樹(shù)Oak楊樹(shù)Poplar棉秸稈Cottonstalk混合材料Hybridmaterials氣生菌絲Aerialmycelium+++++++++++++++白色菌斑Whiteplaque++++++++++++白色菌索Whiterhizomorph++++++++++++紅色菌索Redrhizomorph++-/++++

注：-/+表示無(wú)或剛生成，+表示有形成，+的數(shù)量表示生長(zhǎng)的程度；菌絲(斑、索)形成程度合計(jì)的算法為：+的數(shù)量減去-的數(shù)量所得的差值。

Note：-/+ means no/ trace，+ means accumulation，number of + means accumulations；the calculation method of the accumulations：+ minus -.

表2 不同環(huán)境因素下的蜜環(huán)菌生長(zhǎng)形態(tài)比較

注：-/+表示無(wú)或剛生成，+表示有形成，+的數(shù)量表示生長(zhǎng)的程度；菌絲(斑、索)形成程度合計(jì)的算法為：+的數(shù)量減去-的數(shù)量所得的差值。

Note：-/+ means no/ trace，+ means accumulation，number of + means accumulations；the calculation method of the accumulations：+ minus -.

2.2 不同菌材營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境條件下蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量比較 蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量的多因素方差分析顯示，菌材、溫度對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)影響差異極顯著，菌材與光照的交互作用對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)影響差異顯著，光照與溫度的交互作用對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)影響差異極顯著。其他因子及交互作用對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)影響未達(dá)顯著水平。

對(duì)差異顯著的因子及其互作的進(jìn)一步分析表明(表3)：菌材方面，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量大小順序依次是棉秸稈、混材、櫟樹(shù)、楊樹(shù)，其中棉秸稈和混材、櫟樹(shù)和楊樹(shù)之間差異均不顯著，棉秸稈、混材與櫟樹(shù)、楊樹(shù)之間差異達(dá)極顯著水平；溫度因子方面，溫度越高，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量越大，3個(gè)溫度水平之間差異均極顯著；菌材×光照的交互作用方面，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量大小順序依次是M_G_、H_G_、M_A_、H_A_、L_A_、L_G_、Y_A_、Y_G_，其中棉秸稈×室內(nèi)自然光照、混材×室內(nèi)自然光照條件下差異顯著大于楊樹(shù)×完全黑暗、楊樹(shù)×室內(nèi)自然光照條件下，其他水平組合間差異不顯著；光照×溫度的交互作用方面，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量大小順序依次是__G3、__A3、__G2、__A2、__A1、__G1，不同光照和溫度水平組合差異大，24、20 ℃有光條件下以及16 ℃黑暗條件下蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量均較大。

3 結(jié)論與討論

菌材是蜜環(huán)菌培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，根據(jù)觀察記錄和數(shù)據(jù)分析，菌材的營(yíng)養(yǎng)成分不僅影響蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)形態(tài)，也影響蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)量。蜜環(huán)菌在自然環(huán)境中往往生長(zhǎng)在櫟樹(shù)莖干或根部[6]，有學(xué)者選用20余種闊葉樹(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，認(rèn)為適宜蜜不同因子及互作對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量的多重比環(huán)菌寄生的多為生長(zhǎng)緩慢的殼斗科植物[7]。該試驗(yàn)中，櫟樹(shù)菌材表現(xiàn)出較易生長(zhǎng)白色菌索的特點(diǎn)，甚至有些白色菌索呈培養(yǎng)基中常出現(xiàn)的帶狀，顯示營(yíng)養(yǎng)供給很適宜、充足。棉秸稈、混材上蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量比櫟樹(shù)、楊樹(shù)上大，這種超過(guò)櫟樹(shù)的生長(zhǎng)量主要源于侵染前期的菌絲生長(zhǎng)活動(dòng)，顯示出材質(zhì)疏松的材料易被侵染的特點(diǎn)[8]；棉秸稈、混材上紅色菌索生長(zhǎng)量不弱于櫟樹(shù)，顯示出蜜環(huán)菌對(duì)其供給的營(yíng)養(yǎng)成分也有較好的適應(yīng)性。楊樹(shù)上蜜環(huán)菌可生長(zhǎng)，但適應(yīng)性弱于櫟樹(shù)、棉秸稈及混材上。從生長(zhǎng)形態(tài)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，與秦國(guó)夫等[9-10]的研究結(jié)論一致，pH 5.0條件下菌索生長(zhǎng)較多；黑暗條件下菌絲、菌索都較光照條件下多；高溫條件下菌絲生長(zhǎng)比低溫條件下有優(yōu)勢(shì)，紅色菌索生長(zhǎng)與低溫條件下相比無(wú)優(yōu)勢(shì)。從生長(zhǎng)量分析結(jié)果看，pH和光照條件下差異都不顯著，高溫條件下生長(zhǎng)量顯著高于低溫條件下，差異主要源于菌絲生長(zhǎng)，菌索生長(zhǎng)勢(shì)差異不大。

表3 不同因子及互作對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)量的多重比較

Table 3 Multiple comparisons of different factors and their interactions onArmillariamelleagrowth

因子及互作Factorsandinteractions代號(hào)Code質(zhì)量變化均數(shù)Qualitychangemean∥%菌材MaterialL___0.495bBY___0.471bBM___0.616aAH___0.598aA溫度Temperature___10.480C___20.545B___30.610A菌材×光照L_G_0.489abAMaterial×IlluminationL_A_0.502abAY_G_0.464bAY_A_0.478bAM_G_0.634aAM_A_0.597abAH_G_0.631aAH_A_0.566abA光照×溫度__G10.459eDIllumination×Temperature__G20.560bcB__G30.645aA__A10.501dCD__A20.530cdBC__A30.575bB

注：相同因子同列數(shù)據(jù)后不同大、小寫(xiě)字母分別表示不同處理間在0.01、0.05水平差異顯著。

Note：Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for significant difference at 0.01 and 0.05 level among treatments.蜜環(huán)菌菌絲侵入材料形成菌索，能給天麻、豬苓供養(yǎng)[11]，選用棉花秸稈或混合材料(可考慮以資源充足、營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性較好的菌材代替楊樹(shù))，在微酸性(pH 5.0～6.0，有利于以后菌索生長(zhǎng))、黑暗條件下，以較高的溫度(20～24 ℃)先進(jìn)行氣生菌絲培養(yǎng)，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)進(jìn)入白色菌斑階段后降低溫度至16～20 ℃以促進(jìn)菌索生長(zhǎng)，是人工培養(yǎng)蜜環(huán)菌可選取的方式之一，能部分緩解殼斗科植物生長(zhǎng)緩慢、資源不足的矛盾。

[1] 徐錦堂.中國(guó)天麻栽培學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993：1-294.

[2] 袁崇文，劉智，袁玉清，等.中國(guó)天麻[M].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2002：1-255.

[3] 李志英．縮短天麻栽培周期的研究[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[4] 許廣波，李太元，李艷茹．藥用真菌豬苓研究熱點(diǎn)的進(jìn)展[J]．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(3)：262-266，272.

[5] 楊淑云，林遠(yuǎn)崇，羿紅，等．珍稀食藥用菌——蜜環(huán)菌的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[J]．生物學(xué)雜志，2007，24(3)：52-54.

[6] 劉冰，牛蕓，張德著，等.天麻共生蜜環(huán)菌母種及液體種培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)食用菌，2012，31(3)：28-31.

[7] 宮喜臣.天麻標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)[M]．北京：金盾出版社，2010：67-69.

[8] 張潔，秦俊哲，張大為.菌材及土壤條件對(duì)天麻有效成分的影響[J].食用菌，2009(1)：63-65.

[9] 秦國(guó)夫，趙俊，郭文輝，等.蜜環(huán)菌的生物學(xué)研究進(jìn)展[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32(6)：89-94.

[10] WEINHOLD A R，HENDRIX F F，RAABE R D.Stimulation of rhizomorph growth of Armillaria mellea by indole-3-acetic acid and figwood extract[J].Phytopathology，1962，52(8)：757.

[11] 姚啟華，王紹柏.天麻蜜環(huán)菌材培養(yǎng)技術(shù)的源起、發(fā)展與展望[J]．食用菌，2013(6)：5-6.

Multi-factor Analysis of Influencing Factors onArmillariamelleaCulture

JIANG Ben-li, SU Xiang-feng, CHU Jia-song et al

(Cotton Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, Anhui 230031)

[Objective] The aim was to discuss artificial culture method forArmillariamellea. [Method] The change forms and increment ofArmillariamelleaunder different conditions such as material nutrition, pH, light, temperature were studied. [Result] The results showed that pH value of 5.0 for soaking material and dark conditions are conducive to the growth ofArmillariamellea; High temperature is in favor of aerial mycelium growth and low temperature is in favor of rhizomorph growth; Hybrid material with oak and cotton straw material can provide nutrition rapidly forArmillariamelleaand it is vigorous. [Conclusion] The results can provide theoretical basis for improving technical level of artificial cultivation ofArmillariamellea.

Armillariamellea; Growth form; Increment

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(13B0737)。

江本利(1978- )，男，安徽東至人，助理研究員，從事中藥材種植研究。

2016-07-20

S 646

A

0517-6611(2016)29-0001-02