張玉誠(chéng) 薛 白 達(dá)勒措 李秋瑾 何 宇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都611130)

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混菌固態(tài)發(fā)酵白酒糟開發(fā)為蛋白質(zhì)飼料的條件優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定

張玉誠(chéng) 薛 白*達(dá)勒措 李秋瑾 何 宇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都611130)

本試驗(yàn)旨在優(yōu)化白地霉、米曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌混菌固態(tài)發(fā)酵白酒糟開發(fā)為蛋白質(zhì)飼料的條件，并評(píng)定其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。將白地霉、米曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌按照1∶1∶1∶1混合后按10%接種到培養(yǎng)基中，采用L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共5個(gè)發(fā)酵條件，分別為基料、尿素、磷酸二氫鉀、pH、水分，每個(gè)條件4個(gè)變量，共16組發(fā)酵條件。按條件配制好的混合物放置于(30±2) ℃中培養(yǎng)72 h。對(duì)發(fā)酵前后真蛋白質(zhì)、粗纖維含量進(jìn)行極差分析確定最優(yōu)條件，再比較最優(yōu)條件發(fā)酵前后白酒糟營(yíng)養(yǎng)水平和氨基酸組成的變化。結(jié)果顯示：1)基料按照80%白酒糟、10%麩皮、5%玉米粉、5%菜籽粕配比，尿素添加量為1.5%，磷酸二氫鉀添加量為0.7%，pH為5、水分為50%時(shí)發(fā)酵效果最好，為最優(yōu)發(fā)酵條件。2)最優(yōu)條件下發(fā)酵后白酒糟與發(fā)酵前相比，真蛋白質(zhì)含量提高了57.85%(P<0.01)；粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、粗脂肪含量分別降低了42.39%、31.95%、27.73%、21.48%(P<0.01)；鈣、磷含量分別提高了16.67%和68.18%(P<0.01)；總氨基酸含量提高了24.47%，其中賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸含量分別提高了109.68%、38.09%、39.39%、71.43%、28.93%、10.87%和3.70%。綜上可得，利用白地霉、米曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌混菌發(fā)酵白酒糟的最佳條件是：基料組成80%白酒糟、10%麩皮、5%玉米粉、5%菜籽粕，尿素1.5%，磷酸二氫鉀0.7%，pH 5，水分50%，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量為24.34%。

白酒糟；混菌；固態(tài)發(fā)酵；營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；優(yōu)化

我國(guó)是生產(chǎn)白酒的大國(guó)，白酒糟的年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到3×1010t[1]。然而由于白酒糟粗纖維含量高，動(dòng)物的消化率低下，再加上水分含量極高極易腐敗變質(zhì)，給白酒糟的進(jìn)一步利用帶來很大的困難[2]。有研究表明，微生物能夠利用酒糟中的淀粉、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為自身的代謝產(chǎn)物，并同時(shí)產(chǎn)生脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶等酶類降解酒糟中的纖維素，提高酒糟的蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而改善酒糟的品質(zhì)。酵母菌與霉菌組合具有正協(xié)同作用。盡管米曲霉(Aspergillusoryzae)等霉菌能有效地將淀粉、纖維素降解為酵母菌易利用的單糖類物質(zhì)，合成菌體蛋白[3]。但是米曲霉只產(chǎn)生外切水解肽酶，對(duì)于酒糟中蛋白質(zhì)的利用是有限的。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生活性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)內(nèi)切肽酶、淀粉酶和脂肪酶，其能夠分泌很多動(dòng)物機(jī)體本身所不具有的酶，還有降解飼料中復(fù)雜碳水化合物如果膠、葡聚糖、纖維素等的酶，并且能夠提高飼料中氨基酸含量，彌補(bǔ)其他菌種的不足。綠色木霉(Trichodermaviride)是公認(rèn)的最好的纖維素酶生產(chǎn)菌，它不僅能分解纖維素，還能分解半纖維素和果膠物質(zhì)等其他物質(zhì)。因此本試驗(yàn)選用白地霉(Geotrichumcandidum)、綠色木霉、米曲霉和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtils)混菌對(duì)白酒糟進(jìn)行發(fā)酵，以期優(yōu)化發(fā)酵條件，進(jìn)一步提高白酒糟的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種與培養(yǎng)基

白酒糟購于雅安沙坪酒廠，水分含量為63.45%，干物質(zhì)基礎(chǔ)的營(yíng)養(yǎng)水平如下：粗蛋白質(zhì)16.32%，真蛋白質(zhì)15.01%，粗纖維34.90%，酸性洗滌纖維55.60%，中性洗滌纖維65.39%，粗脂肪2.58%，粗灰分12.65%，鈣0.22%，磷0.18%。麩皮、菜籽粕、玉米粉購于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所試驗(yàn)場(chǎng)。白地霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、綠色木霉購于中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心，供試菌種所用培養(yǎng)基及主要作用見表1。

表1 供試菌種所用培養(yǎng)基及主要作用

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g去皮的馬鈴薯，切碎，加入800 mL蒸餾水，放在電爐上煮沸30 min左右，用8層紗布過濾，留取濾液，加入20 g葡萄糖，加水至1 000 mL。(如配制固體培養(yǎng)基需加入20 g瓊脂，定容至1 000 mL)。121 ℃高壓滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基:15 g瓊脂，5Be麥芽汁定容至1 000 mL，，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏淀粉培養(yǎng)基:牛肉膏20 g，淀粉20 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2, 121 ℃滅菌20 min。

1.1.2 菌種活化

用無菌吸管吸取0.5 mL的液體培養(yǎng)基于安瓿管中將干燥菌體全部溶解，吸出并放入盛有4～5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，白地霉和米曲霉用麥芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～5 d。綠色木霉用PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～7 d?？莶菅挎邨U菌用牛肉膏淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d，活化2～3代。

1.1.3 微生物種子準(zhǔn)備

綠色木霉用PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)至菌絲鋪滿斜面，米曲霉用麥芽汁培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)5～7 d，用適量無菌水將孢子沖洗，4層擦鏡紙過濾，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸液的濃度，稀釋至1×107CFU/mL，備用；白地霉液體培養(yǎng)基28 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)至濃度約為1×107CFU/mL；枯草芽孢桿菌用牛肉膏培養(yǎng)基28 ℃、250 r/min搖瓶培養(yǎng)至濃度約為1×107CFU/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

白地霉、米曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌按照1∶1∶1∶1混合后按10%接種到培養(yǎng)基中。采用L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共5個(gè)發(fā)酵條件，分別為基料(A)、尿素(B)、磷酸二氫鉀(C)、pH(D)、水分(E)，每個(gè)條件4個(gè)變量，共16組發(fā)酵條件。發(fā)酵條件L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表2。按條件配制好的混合物放置于(30±2) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每隔12 h攪拌1次，防止內(nèi)部溫度太高，試驗(yàn)結(jié)束后取一部分立即測(cè)定水分，剩下部分烘干待測(cè)。首先通過真蛋白質(zhì)和粗纖維含量2個(gè)指標(biāo)篩選出最優(yōu)的發(fā)酵條件，然后在最優(yōu)的發(fā)酵條件下發(fā)酵白酒糟，測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)水平和氨基酸含量，比較發(fā)酵前后的變化。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

發(fā)酵結(jié)束后將樣品置于鼓風(fēng)干燥烘箱65 ℃烘干，制備成風(fēng)干樣品。真蛋白質(zhì)含量的測(cè)定利用過量的氫氧化銅將真蛋白質(zhì)沉淀，用水洗去水溶性含氮物。沉淀部分利用凱氏定氮的方法測(cè)定真蛋白質(zhì)含量[4]；利用酸堿洗滌法測(cè)定粗纖維含量；測(cè)定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量時(shí)，在沉淀中分別加入酸性洗滌液和中性洗滌液洗滌微沸1 h，之后用熱蒸餾水洗去可溶物，105 ℃將剩余物質(zhì)烘干，具體參照Van Soest等[5]方法進(jìn)行；鈣含量利用高錳酸鉀滴定法測(cè)定；磷含量利用鉬黃分光光度計(jì)比色法測(cè)定[6]；氨基酸含量采用氨基酸自動(dòng)分析儀(日立L-8900)測(cè)定，具體參照張麗英[7]的方法。

表2 發(fā)酵條件L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

發(fā)酵條件括號(hào)外為編號(hào)，括號(hào)內(nèi)為具體條件參數(shù)。

Fermentation condition outside the bracket was coding No., and those inside the bracket was specific condition parameters.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)首先用Excel 2007進(jìn)行初步整理，然后再用SPSS 19.0處理、分析，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析與方差分析，顯著性采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵正交試驗(yàn)真蛋白質(zhì)含量極差分析

由表3極差分析可知，影響真蛋白質(zhì)含量的效應(yīng)依次為B、A、E、C、D，即主要影響因素是尿素，次要影響因素依次為基料、水分、磷酸二氫鉀和pH，最優(yōu)的組合為A4B3C4D1E1。直觀分析可以得到，真蛋白質(zhì)含量最高組是9組，組合為A4B3C2D1E2，真蛋白質(zhì)含量是23.95%，與未發(fā)酵的白酒糟相比，真蛋白質(zhì)含量提高了59.56%。這與極差分析的最佳組合不一致，因此需要進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.2 混菌發(fā)酵正交試驗(yàn)粗纖維含量極差分析

由表4極差分析可知，影響粗纖維含量的效應(yīng)依次為A、C、B、D、E，說明發(fā)酵白酒糟纖維素降解的主要影響因素是基料，次要影響因素依次是磷酸二氫鉀、尿素、pH和水分。因此可以得到降解纖維的最優(yōu)組合為A4B3C4D1E1，與以真蛋白質(zhì)含量篩選的結(jié)果一致。直觀分析可以得到15組的纖維素含量最低為20.23%，相比較未發(fā)酵的白酒糟降低了42.03%。

2.3 最優(yōu)組合發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)水平的比較

由表5可知，發(fā)酵后白酒糟真蛋白質(zhì)含量極顯著的高于發(fā)酵前(P<0.01),相比較發(fā)酵前提高了57.85%。發(fā)酵后粗纖維含量極顯著低于發(fā)酵前(P<0.01)，降低了42.39%，并且，酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量也相應(yīng)呈現(xiàn)極顯著的降低(P<0.01)，分別降低了31.95%和27.73%。粗脂肪含量發(fā)酵后極顯著地低于發(fā)酵前，但是粗灰分、鈣和磷含量發(fā)酵后極顯著的高于發(fā)酵前(P<0.01)，分別提高了4.42%、16.67%和68.18%。

表3 混菌發(fā)酵L16(45)正交試驗(yàn)真蛋白質(zhì)含量極差分析

K1、K2、K3、K4分別表示對(duì)應(yīng)編號(hào)的發(fā)酵條件下得到數(shù)據(jù)的平均值；R表示極差，即K1、K2、K3、K4的最大值減去最小值。下表同。

K1, K2， K3 and K4 were average values of data calculated under fermentation conditions with corresponding coding No.. R was the range, and was the difference of the maximum and minimum of K1， K2， K3 and K4. The same as below.

表4 混菌發(fā)酵L16(45)正交試驗(yàn)粗纖維含量極差分析

續(xù)表4組號(hào)GroupNo.發(fā)酵條件FermentationconditionABCDE粗纖維CF/%94321220.40102314424.52113412223.44122143223.37134132422.45143241421.58154444120.23164213322.97K127.9424.7125.0023.2323.38K223.1723.8923.7723.8523.84K322.5823.3023.4423.8723.85K421.5323.3522.9524.2124.11R6.411.412.050.980.73

表5 最優(yōu)組合發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)水平的比較(干物質(zhì)基礎(chǔ))

增長(zhǎng)率=100×(發(fā)酵后-發(fā)酵前)/發(fā)酵前。下表同。

Growth rate=100×(after fermentation-before fermentation)/before fermentation. The same as below.

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01).

2.4 最優(yōu)組合發(fā)酵前后氨基酸組成的比較

由表6可知，發(fā)酵后總氨基酸含量為16.58%，相比發(fā)酵前提高了24.47%。發(fā)酵后除了胱氨酸含量比發(fā)酵前下降了11.43%，其余氨基酸含量均有不同程度的提高，其中賴氨酸含量增幅最高，比發(fā)酵前提高了109.68%，必需氨基酸中蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和脯氨酸分別提高了38.09%、39.39%、71.43%、28.93%、10.87%和3.70%。非必需氨基酸含量的總體增幅略低于必需氨基酸。

3 討 論

3.1 白酒糟發(fā)酵條件的優(yōu)化

基料的組成不同嚴(yán)重影響微生物發(fā)酵產(chǎn)物的優(yōu)劣。白酒糟作為釀酒的副產(chǎn)物自身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不均衡，因此需要在培養(yǎng)基中加入其他原料來平衡。麩皮、玉米粉和菜籽粕含有豐富的碳源，發(fā)酵中適量添加不僅可以改善白酒糟的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，而且增加培養(yǎng)基的蓬松程度，有助于氧氣的流通，促進(jìn)好氧菌的生長(zhǎng)。郭志等[8]研究表明，添加麩皮和玉米粉能夠顯著提高熱帶假絲酵母、黑曲霉和綠色木霉混菌對(duì)白酒糟的發(fā)酵效果。焦肖飛等[9]研究表明，當(dāng)麩皮的添加量小于15%時(shí)，隨著麩皮添加量的逐漸提高，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。張博潤(rùn)等[10]添加10%的菜籽粕對(duì)白酒糟發(fā)酵也有顯著的改善作用。本試驗(yàn)得到，添加10%麩皮、5%玉米粉和5%菜籽粕組發(fā)酵效果最好，真蛋白質(zhì)含量最高，并且粗纖維含量最低，顯著優(yōu)于其他組。

表6 最優(yōu)組合發(fā)酵前后氨基酸組成的比較(干物質(zhì)基礎(chǔ))

水分是微生物生長(zhǎng)不可缺少的因素。微生物能夠在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，一般固態(tài)培養(yǎng)基水分含量大于時(shí)40% 微生物可以繁殖，當(dāng)培養(yǎng)基中有一定自由流動(dòng)水時(shí)，微生物的代謝產(chǎn)物及各種酶滲透流動(dòng)進(jìn)入基質(zhì)內(nèi)，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)繁殖，改善白酒糟的品質(zhì)。劉達(dá)玉等[11]組合菌種發(fā)酵酒糟制備蛋白質(zhì)飼料研究得到，發(fā)酵培養(yǎng)基水分達(dá)到50%～60%時(shí)，產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中水分含量為50%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量最高，在實(shí)際生產(chǎn)中水分越低越有利于產(chǎn)品的推廣。

發(fā)酵底物的初始pH也是影響微生物生長(zhǎng)情況的重要因素之一，適宜的pH條件有利微生物生長(zhǎng)，否則會(huì)抑制生長(zhǎng)。侯文華等[12]研究表明，pH為5.5時(shí)自選菌種8505和8503發(fā)酵酒糟粗蛋白質(zhì)含量最高，比未發(fā)酵提高了23.75%，當(dāng)pH大于6.0時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量顯著下降。然而，孫東偉等[13]采用多菌種固態(tài)混合發(fā)酵得到，pH為6.31時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高。董文豪等[14]研究得到，菌種發(fā)酵的最適宜pH為9.0。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，混菌發(fā)酵pH為5.0時(shí)，菌種發(fā)酵的真蛋白質(zhì)含量最高。不同學(xué)者研究結(jié)果都不相同，這可能是由于發(fā)酵所選的菌種各不相同，而不同菌種生長(zhǎng)所需的最適宜pH存在差異。

鉀不僅是生物體內(nèi)各種重要酶系的激活劑，而且也作為電解質(zhì)維持滲透壓、調(diào)節(jié)酸堿平衡、控制水的代謝。磷是生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)底物磷酸化的重要參與者，是生命遺傳物質(zhì)和眾多酶類的組成部分。因此，本試驗(yàn)通過添加磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)鉀和磷元素含量。易弋等[15]研究表明，培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀含量為0.6%時(shí)，發(fā)酵白酒糟中菌體的密度最大。本試驗(yàn)結(jié)果得到，磷酸二氫鉀添加0.7%時(shí)，發(fā)酵白酒糟真蛋白質(zhì)含量最高。這與易弋等[15]的研究結(jié)果相近。

微生物能夠利用非蛋白氮轉(zhuǎn)化為自身代謝產(chǎn)物的一部分，因此可以添加外源氮提高發(fā)酵產(chǎn)物中的真蛋白質(zhì)含量。李日強(qiáng)等[16]研究表明，白酒糟中添加2%的尿素，白酒糟中真蛋白質(zhì)的含量最高。陸娟等[17]利用枯草芽孢桿菌和熱帶假絲酵母混菌發(fā)酵得到白酒糟中添加3%的尿素最適宜。然而本試驗(yàn)結(jié)果表明，白酒糟中添加1.5%尿素真蛋白質(zhì)含量最高，低于這2位學(xué)者的研究結(jié)果，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵菌種和白酒糟原料的不同所致。當(dāng)尿素含量大于1.5%時(shí)真蛋白質(zhì)含量下降，這可能是由于微生物對(duì)外源氮的轉(zhuǎn)化是有限的，超過最佳的添加量并不能提高發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量。

3.2 最優(yōu)發(fā)酵條件對(duì)白酒糟營(yíng)養(yǎng)水平的影響

白酒糟經(jīng)過微生物發(fā)酵能夠極大地改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。宋善丹等[18]選用產(chǎn)朊假絲酵母、黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌進(jìn)行組合發(fā)酵，最優(yōu)條件組的粗蛋白質(zhì)、真蛋白質(zhì)含量均顯著增高，同時(shí)酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量也降低了，陳風(fēng)風(fēng)[19]利用混菌固態(tài)發(fā)酵白酒糟，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)含量提高了27.44%，中性洗滌纖維含量降低了5.53%。王炫等[20]采用白地霉和假絲酵母混菌發(fā)酵白酒糟，白酒糟的粗纖維降解20.1%，粗脂肪降解61.81%。鐘世博等[21]以綠色木霉和熱帶假絲酵母混菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵白酒糟，得到發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量有所提高。孫東偉等[13]將白地霉、黑曲霉、米曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母共同混合發(fā)酵酒糟，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量上升，粗纖維含量顯著下降，酒糟的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到改善和提高。郭素環(huán)等[22]將乳酸菌、班圖酒香酵母、綠色木霉和枯草芽孢桿菌等比例混合發(fā)酵，在最優(yōu)條件下產(chǎn)物中的真蛋白質(zhì)含量顯著高于未發(fā)酵的白酒糟，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和粗纖維的含量降幅最大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用白地霉、綠色木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌等比例混合固態(tài)發(fā)酵，最優(yōu)條件下發(fā)酵白酒糟的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)水平優(yōu)于發(fā)酵之前，真蛋白質(zhì)含量提高57.85%，這一增幅相比較宋善丹等[18]、陳風(fēng)風(fēng)[19]、鐘世博等[21]的15.67%、27.44%、43.40%分別提高了269.18%、110.82%、33.29%，粗纖維含量降幅相比較王炫等[20]的結(jié)果提高110.89%，但是粗脂肪含量降幅卻低了65.20%，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解量相比較宋善丹等[18]的結(jié)果分別提高了12.30%和68.23%，但是相對(duì)于郭素環(huán)等[22]卻低了22.50%和15.56%。造成以上這些不同的原因可能是由于本試驗(yàn)所選的菌種之間代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生最佳的互補(bǔ)作用，并且添加了磷酸二氫鉀作為各種酶系的激活劑，使得發(fā)酵產(chǎn)生更多的蛋白酶、纖維素降解酶。同時(shí)微生物也可以利用尿素和菜籽粕的非蛋白氮轉(zhuǎn)化為真蛋白質(zhì)和各種小肽，進(jìn)而提高了發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵后白酒糟粗灰分含量提高了4.42%，鈣含量提高了16.67%，磷含量提高了68.18%。這可能是由于在發(fā)酵的過程中，微生物產(chǎn)生二氧化碳得到釋放，造成有機(jī)物的損失，從而引起以上產(chǎn)物相對(duì)含量的提高。

3.3 最優(yōu)發(fā)酵條件對(duì)白酒糟氨基酸組成的影響

反芻動(dòng)物的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)主要是將其降解為氨基酸進(jìn)行吸收，進(jìn)入血液參與機(jī)體的代謝。盡管白酒糟的氨基酸含量非常豐富，但是其氨基酸組成極其不平衡。白酒糟通過微生物的發(fā)酵，在充足的碳源、氮源和礦物質(zhì)的條件下，合成了大量的氨基酸。本試驗(yàn)在最優(yōu)條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中除了半胱氨酸外其他氨基酸含量均有不同程度的增加，尤其是反芻動(dòng)物的限制性氨基酸賴氨酸、蛋氨酸、組氨酸[23]，分別比發(fā)酵前提高了109.68%、38.09%、19.51%。Mullins等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼糧中賴氨酸與蛋氨酸的比例為3∶1時(shí)，犢牛的生長(zhǎng)性能最好并且達(dá)到最大的氮利用率。本試驗(yàn)結(jié)果得到，發(fā)酵前賴氨酸與蛋氨酸的比例為1.47∶1.00，發(fā)酵后賴氨酸與蛋氨酸的比例為2.24∶1.00，發(fā)酵后的比例與Mullins等[24]的結(jié)果相近，說明發(fā)酵后的白酒糟對(duì)于反芻動(dòng)物來說利用價(jià)值更高。Wang等[25]研究結(jié)果表明，肉牛飼糧中賴氨酸和蘇氨酸的適宜比例為1.00∶0.65，與本試驗(yàn)的結(jié)果相近。胱氨酸是一種含硫氨基酸，參與到谷胱甘肽和?；撬岬然钚晕镔|(zhì)的合成，對(duì)于動(dòng)物的氧化、免疫等具有重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，胱氨酸的含量呈現(xiàn)一定幅度的下降，這可能與胱氨酸參與微生物代謝過程中生理活動(dòng)有關(guān)，具體原因需要進(jìn)一步研究。

通過聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)和雞蛋蛋白質(zhì)理想氨基酸模式評(píng)分(表7)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后必需氨基酸占總氨基酸的比值為0.37，接近FAO/WHO提出的0.4。必需氨基酸與非必需氨基酸比值為0.59，也是接近FAO/WHO提出的0.6[26]。蘇氨酸、賴氨酸和異亮氨酸含量是FAO/WHO理想氨基酸模式的47.25%、48.55%和52.25%，雞蛋蛋白質(zhì)被認(rèn)為是最優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，只有雞蛋蛋白質(zhì)的28.64%、41.72%、40.98%，因此這3種氨基酸分別是發(fā)酵白酒糟的第一、第二和第三限制性氨基酸。然而發(fā)酵后的白酒糟苯丙氨酸+酪氨酸的含量是FAO/WHO理想氨基酸模式的104.83%，優(yōu)于FAO/WHO理想蛋白質(zhì)，并且亮氨酸含量也接近理想氨基酸模式。與動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要相比較，亮氨酸和纈氨酸含量高于生長(zhǎng)蛋雞和瘦肉型豬(2～20 kg)的營(yíng)養(yǎng)需要量[27]。

表7 發(fā)酵白酒糟氨基酸組成與理想氨基酸模式的比較

發(fā)酵白酒糟的必需氨基酸理想氨基酸平衡模式高于豬，但是蘇氨酸含量接近，相差只有6%；發(fā)酵白酒糟的理想氨基酸平衡模式高于肉牛；然而毛發(fā)的理想氨基酸平衡模式高于發(fā)酵白酒糟；蛋雞對(duì)于異亮氨酸、蛋氨酸+胱氨酸和蘇氨酸的需要量與發(fā)酵白酒糟的理想氨基酸平衡模式相近(表8)。

表8 理想氨基酸平衡模式的比較

4 結(jié) 論

① 利用白地霉、米曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌混菌發(fā)酵白酒糟的最佳條件是：基料組成80%白酒糟、10%麩皮、5%玉米粉、5%菜籽粕，尿素1.5%，磷酸二氫鉀0.7%，pH 5，水分50%。

② 最優(yōu)條件下發(fā)酵的白酒糟真蛋白質(zhì)、粗纖維和總氨基酸含量分別為24.34%、20.06%和16.58%。

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*Corresponding author, professor, E-mail: xuebai68@163.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Distillers Grains: Optimization of Mixed Bacterial Solid-State Fermentation Conditions to Produce Protein Feed and Nutrient Value Analysis

ZHANG Yucheng XUE Bai*Dalecuo LI Qiujin HE Yu

(Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

This experiment was conducted to optimize mixed bacterial (Geotrichumcandidum,Aspergillusoryzae,TrichodermavirideandBacillussubtils) solid-state fermentation conditions to produce protein feed, and analyzed the nutrient value.Geotrichumcandidum,Aspergillusoryzae,TrichodermavirideandBacillussubtils(1∶1∶1∶1) was added to culture medium at 10%. L16(54)orthogonal testing design was used, and 5 fermentation conditions with 4 variables were set (16 groups of fermentation conditions in all). The conditions were base materials, urea, potassium di-hydrogen phosphate, pH and moisture. The mixtures prepared according to the conditions were cultured under (30±2) ℃ for 72 h. Range analyses for true protein and crude fiber contents before and after fermentation were carried out to determine the optimal conditions, and comparisons of nutrient levels and amino acid composition of distillers grains between before and after fermentation under optimal condition were done. The results showed as follows: 1) the optimal combination was that base materials of 80% distillers grains, 10% wheat bran, 5% corn flour and 5% rapeseed meal supplemented with 1.5% adding urea and 0.7% potassium di-hydrogen phosphate with pH 5 and 50% moisture. 2) True protein content of distillers grains after fermentation improved by 57.85% compared with that before fermentation (P<0.01); the contents of crude fiber, acid detergent fiber, neutral detergent fiber and ether extract were reduced by 42.39%, 31.95%, 27.73% and 21.48% (P<0.01), respectively; and the contents of calcium and phosphorus were increased by 16.67% and 68.18% (P<0.01), respectively; total amino acids content was increased by 24.47%, and the contents of lysine, methionine, threonine, valine, leucine, isoleucine and proline were increased by 109.68%, 38.09%, 39.39%, 71.43%, 28.93%, 10.87% and 3.70%, respectively. In conclusion, the optimal conditions for of distillers grains solid-state fermentation usingGeotrichumcandidum,Aspergillusoryzae,TrichodermavirideandBacillussubtilsare as follows: base materials of 80% distillers grains, 10% wheat bran, 5% corn flour and 5% rapeseed meal supplemented with 1.5% urea and 0.7% potassium di-hydrogen phosphate with pH 5 and 50% moisture. True protein content of fermented distillers grains is 24.34.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3711-3720]

distillers grains; mixed bacteria; solid-state fermentation; nutrient value; optimum

2016-05-16

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川區(qū)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

張玉誠(chéng)(1989—)，男，甘肅景泰人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail: zhang23yu@sina.com

*通信作者：薛 白，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: xuebai68@163.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.042

S816.6

A

1006-267X(2016)11-3711-10