曹榮安，李良玉，林劍，瞿東楊，張邢晨，賈建

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)；3.龍游伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司）

白鮮皮多糖的提取及分子特性研究

曹榮安1，李良玉2，林劍3，瞿東楊1，張邢晨1，賈建1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心/黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)；3.龍游伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司）

以白鮮皮為原料提取多糖，優(yōu)化提取參數(shù)，分析其分子特性。首先在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化白鮮皮多糖的提取參數(shù)，最佳參數(shù)為液料比23.87（mL：g）、溫度87.71℃、提取時(shí)間2.38 h，多糖得率為7.1%。白鮮皮多糖的化學(xué)組成為86.1%總糖、9.2%蛋白質(zhì)和7.1%糖醛酸，單糖組成主要為85.5%葡萄糖，同時(shí)還含有5.2%半乳糖、4.7%阿拉伯糖、2.0%木糖、1.4%鼠李糖、1.1%甘露糖和0.1%巖藻糖。分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布情況研究表明，在RI色譜圖洗脫時(shí)間44～53 min白鮮皮多糖存在一個(gè)對(duì)稱峰，其分子質(zhì)量為369.9×103u，回轉(zhuǎn)半徑為250.0 nm。

白鮮皮；多糖；提?。环肿犹匦?/p>

白鮮（Dictamnus L.）是蕓香科白鮮屬多年生草本植物，有濃烈的特殊氣味，主要分布在亞洲大陸，約有五種，我國(guó)有白鮮（Dictamnus L.）和新疆白鮮（Dictamnus angustifolius G.Don.）兩種［1］。白鮮皮（Dictamnus dasycarpus Turcz）為白鮮的干燥根皮，為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，其味苦、性寒?！端幮哉摗分性?jīng)記載，白鮮皮治一切熱毒風(fēng)、惡風(fēng)、風(fēng)瘡、疥癬赤爛、眉發(fā)脫脆、皮肌急、壯熱惡寒，主解熱黃、酒黃、急黃、谷黃、勞黃等?！吨袊?guó)藥典》收載記錄其功能主治有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒，用于濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風(fēng)疹、疥癬瘡癩、風(fēng)濕熱痹、黃疸尿赤［2］。現(xiàn)代研究表明白鮮皮的藥理作用有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗內(nèi)毒素、抗過(guò)敏、殺蟲、止血、保護(hù)神經(jīng)和肝臟等作用［3-16］，臨床上主要用于治療慢性支氣管炎、皮膚脫皮癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、外出血、蕁麻疹、濕疹等［17-18］。目前，從白鮮皮中分離得到的化學(xué)成分包括生物堿類、檸檬苦素類、倍半萜及其倍半萜昔類、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類、甾體類及多糖化合物等［19-25］，但對(duì)白鮮皮多糖的研究報(bào)道很少。試驗(yàn)以白鮮皮為原料提取多糖，研究提取參數(shù)，之后分析化學(xué)成分、單糖組成和分子量，為白鮮皮多糖的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鮮皮（市購(gòu)，產(chǎn)地黑龍江），蛋白質(zhì)定量試劑盒（DC protein assay kit）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，單糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白、明膠、葡萄糖醛酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3802 UV/VZS分光光度計(jì)，美國(guó)Unico公司；TSK Gel色譜柱，日本TOSOH公司；2487紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；DAWN HELEOS多角度激光光散射檢測(cè)器，美國(guó)Wyatt公司；2414示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；6890N/MSD5973氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS），美國(guó)Agilent公司。

1.3 白鮮皮多糖提取參數(shù)研究

1.3.1 提取工藝

原料挑選除雜烘干后研磨過(guò)40目篩，加入85%乙醇70℃加熱回流攪拌2 h后室溫?cái)嚢?2 h，離心后沉淀加入無(wú)水乙醇室溫?cái)嚢瑁x心去上清液后沉淀自然干燥。加入蒸餾水進(jìn)行浸提，離心后收集提取液，殘?jiān)凑障嗤绦蛟偬崛∫淮?，合并兩次的提取液，真空濃縮后加入乙醇使最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，攪拌10 min后放入4℃冰箱中靜置12 h，離心后棄去上清液，沉淀加入無(wú)水乙醇洗滌兩次，離心后沉淀室溫干燥。稱重計(jì)算多糖得率，公式為：多糖得率/%=（提取得到的多糖質(zhì)量/水提時(shí)原料質(zhì)量）×100。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1液料比對(duì)多糖得率的影響：選取液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL∶g），提取溫度85℃，提取時(shí)間2 h，進(jìn)行多糖的提取，研究液料比對(duì)多糖得率的影響。1.3.2.2提取溫度對(duì)多糖得率的影響：液料比15∶1（mL∶g），選取提取溫度分別為75、80、85、90、95℃，提取時(shí)間2 h，進(jìn)行多糖的提取，研究提取溫度對(duì)多糖得率的影響。

1.3.2.3提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響：液料比15∶1（mL∶g），提取溫度85℃，選取提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，進(jìn)行多糖的提取，研究提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)二次回歸組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)液料比、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 化學(xué)成分分析

總糖含量測(cè)定參照Dubois等人的苯酚-硫酸法［26］，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品；蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Lowry法（福林酚法）［27］，使用的是蛋白質(zhì)定量試劑盒，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；硫酸根含量測(cè)定采用Dodgson和Price的氯化鋇-明膠濁度法［28］，硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)品；糖醛酸含量測(cè)定采用Filisetti-Cozzi和Carpita的間羥基聯(lián)苯法［29］，葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 單糖組成分析

參考Ciucanu的方法并稍作改動(dòng)［30］，樣品和七種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）分別加入三氟乙酸，100℃水解6 h，經(jīng)過(guò)還原和乙?；频孟鄳?yīng)的糖醇乙酸酯衍生物。注入1 μL到GC-MS中進(jìn)行分析，采用的是HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.2 mL·min-1。升溫程序?yàn)?60～210℃（10 min之內(nèi)），之后10 min升溫到240℃，速度為5℃·min-1，保持在250℃，進(jìn)樣口溫度也保持在250℃。用電子轟擊源分析，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為35～450 m·z-1。根據(jù)氣譜出峰時(shí)間和質(zhì)譜的離子峰與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比從而確定單糖組成。

1.6 分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布測(cè)定

多糖配置成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，60℃加熱溶解，膜過(guò)濾后注入高效尺寸排阻色譜-紫外檢測(cè)器-多角度激光光散射儀-示差折光檢測(cè)器聯(lián)用（HPSEC-UV-MALLS-RI）系統(tǒng)中檢測(cè)，結(jié)果分析采用ASTRA 6.1軟件（Wyatt Technology Corp）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)采用M±SD表示，采用Sigmaplot 12.0作圖。應(yīng)用SAS 8.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各試驗(yàn)組之間的顯著性差異分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和鄧肯氏復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 白鮮皮多糖提取參數(shù)

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)影響白鮮皮多糖得率的三個(gè)因素液料比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍谝毫媳?0∶1～25∶1（mL∶g）范圍內(nèi)，隨著液料比的增大多糖得率呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），當(dāng)液料比為25∶1（mL∶g）時(shí)多糖得率最高為6.69%，之后隨著液料比的升高，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此，實(shí)驗(yàn)選擇響應(yīng)面優(yōu)化液料比范圍為以25∶1為中心，20∶1到30∶1之間。在提取溫度75～90℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高多糖得率顯著增加（P＜0.05），當(dāng)提取溫度為90℃時(shí)多糖得率最高為6.72%，之后提取溫度升高到95℃，多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此，實(shí)驗(yàn)選擇響應(yīng)面優(yōu)化提取溫度范圍為以90℃為中心，85℃到90℃之間。而提取時(shí)間對(duì)于多糖得率的影響呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，在1.0～3.0 h范圍內(nèi)，多糖得率一直升高，2.5 h后趨于平穩(wěn)，實(shí)驗(yàn)選擇響應(yīng)面優(yōu)化提取時(shí)間范圍為以2 h為中心，1.5 h到3 h之間。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1The results of single factor experiment

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果確定的取值范圍，以液料比、提取溫度和提取時(shí)間這三個(gè)因素為自變量（分別以X1、X2、X3表示），以多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的三元二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)點(diǎn)最少前提下提高多糖得率。因素水平編碼表見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平編碼表Table1Coding table of factor levels

表2 試驗(yàn)安排表以及試驗(yàn)結(jié)果Table 2Scheme and results of regression orthogonal rotary design

續(xù)表2試驗(yàn)安排表以及試驗(yàn)結(jié)果Continued table 2Scheme and results of regression orthogonal rotary design

2.1.2.1 多因素組合優(yōu)化試驗(yàn)分析

對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析（RSREG），回歸方程以及回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，二次回歸參數(shù)模型數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表3 回歸方程的方差分析表Table 3The ANOVA of regession equation

由表3可知，二次回歸模型的F值為25.83，P＜0.05，大于在0.05水平上的F值，而失擬項(xiàng)的F值為0.83，小于在0.05水平上的F值，說(shuō)明該模型擬和結(jié)果好。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的F值均大于0.05水平上的F值，說(shuō)明其對(duì)多糖得率影響顯著。根據(jù)表4的參數(shù)，以多糖得率為Y值，得出液料比、提取溫度、提取時(shí)間的編碼值為自變量的三元二次回歸方程為：

表4 二次回歸模型參數(shù)表Table 4The parameters of quadratic regression

2.1.2.2 最優(yōu)提取條件確定

為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的值，對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行響應(yīng)面典型分析，以獲得最大得率時(shí)的條件，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最優(yōu)提取條件及多糖得率Table 5The optimization extraction condition and yield

由表5可以看出，液料比為23.87、溫度87.71℃、提取時(shí)間2.38 h，多糖的得率最大，理論最大得率為7.2%。

2.1.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)提取條件進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)三次，白鮮皮多糖得率為7.1±0.4%，試驗(yàn)值與模型的理論值非常接近，試驗(yàn)條件重現(xiàn)性良好，該模型可以較好的反映出提取白鮮皮多糖的條件。李淑惠等報(bào)道的白鮮皮粗多糖收率為9.7%，高于實(shí)驗(yàn)的多糖得率，其總糖含量為79.20%，而實(shí)驗(yàn)提取的多糖總糖含量為86.1%，同時(shí)多糖得率的差異也與選取的原材料和提取參數(shù)不同有關(guān)［25］。同時(shí)也有利用響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英多糖工藝研究，提高了提取率［31］。

2.2 白鮮皮多糖的化學(xué)成分和單糖組成

對(duì)白鮮皮多糖的化學(xué)成分和單糖組成進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。白鮮皮多糖主要由86.1%總糖、9.2%蛋白質(zhì)和7.1%糖醛酸組成，同時(shí)未檢測(cè)出硫酸根。李淑惠等報(bào)道的白鮮皮粗多糖中總糖含量為79.20%［25］，低于本實(shí)驗(yàn)的總糖含量，這也是為何本實(shí)驗(yàn)的多糖得率低于其多糖得率的原因。同時(shí)由圖2和表6可知，白鮮皮多糖的主要單糖為葡萄糖（85.5%），還含有少量的半乳糖（5.2%）、阿拉伯糖（4.7%）、木糖（2.0%）、鼠李糖（1.4%）、甘露糖（1.1%）和微量的巖藻糖（0.1%）。

圖2 白鮮皮多糖糖醇乙酸酯衍生物的總離子流色譜圖Fig.2Chromatogram of total ion current spectra for the alditol acetates derivatives of polysaccharides from Dictamnus dasycarpus Turcz

表6 白鮮皮多糖的化學(xué)成分和單糖組成Table 6Chemical and monosaccharide compositions of the polysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

2.3 白鮮皮多糖的分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布

采用HPSEC-UV-MALLS-RI聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)白鮮皮多糖的分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布情況進(jìn)行了研究，RI和UV色譜圖見(jiàn)圖3。白鮮皮多糖RI檢測(cè)曲線在洗脫時(shí)間44～53 min存在一個(gè)峰形對(duì)稱的峰，說(shuō)明其是均一多糖。同時(shí)也存在較小的UV檢測(cè)峰，這與前面化學(xué)組成中蛋白質(zhì)含量是相互吻合的。同時(shí)利用ASTRA 6.1軟件進(jìn)行分析，得到分子質(zhì)量（Mw）和回轉(zhuǎn)半徑（Rg）的數(shù)值，由表7可知Mw為369.9×103μ，Rg為250.0 nm。

圖3 白鮮皮多糖的RI和UV色譜圖Fig.3RI and UV chromatograms of the polysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

表7 白鮮皮多糖的分子質(zhì)量和回轉(zhuǎn)半徑Table 7Molecular weight and radius of gyration for thepolysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了白鮮皮多糖的提取條件，最佳提取參數(shù)為液料比23.87（mL∶g）、溫度87.71℃、提取時(shí)間2.38 h，多糖的得率為7.1%。之后對(duì)提取得到的白鮮皮多糖進(jìn)行了分子特性研究，其總糖含量為86.1%，同時(shí)含有一定量的蛋白質(zhì)和糖醛酸，單糖組成主要為葡萄糖，同時(shí)還含有少量的其他單糖。在RI色譜圖中存在一個(gè)對(duì)稱峰，分子質(zhì)量和回轉(zhuǎn)半徑分別為369.9×103μ和250.0 nm。通過(guò)研究明確了白鮮皮多糖的提取參數(shù)和分子特性，這為下一步的純化和生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

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Extraction and Molecular Characterization Research of the Polysaccharide from Dictamnus dasycarpus Turcz

Cao Rong’an1，Li Liangyu2，Lin Jian3，Qu Dongyang1，Zhang Xingchen1，Jia Jian1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.Longyou Yili Dairy CO.，LTD）

DictamnusdasycarpusTurczasasrawmaterials，theoptimizationoftheextractionparametersandmolecular characterization of the polysaccharide were investigated.The extraction parameter were as follows，the ratio of liquid to material 23.87（mL：g），temperature 87.71℃，extraction time 2.38 h，with the yield of 7.1%，which was analyzed by the response surface experiments on basis of the results of single factor experiment.The chemical composition of the polysaccharide was mainly composed of 86.1%total carbohydrate，9.2%protein and 7.1%uronic acid.The major monosaccharide of the polysaccharide was glucose（85.5%），along with limited amounts of galactose（5.2%），arabinose（4.7%），xylose（2.0%），rhamnose（1.4%），mannose（1.1%）and fucose（0.1%）.According to the analysis of molecular weight and molecular weight distribution，there was a symmetrical peak during the elution time of 44～53 min in the RI chromatogram with the molecular weight 369.9×103u and radius of gyration 250.0 nm.

Dictamnus dasycarpus turcz；polysaccharide；extraction；molecular characterization

TS201.1

A

1002-2090（2016）04-0065-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.015

2015-04-20

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動(dòng)計(jì)劃（XDB2015-30）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)2014年度校內(nèi)培育課題（XZR2014-08）；2015年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510223010）。

曹榮安（1980-），男，講師，韓國(guó)江陵原州大學(xué)畢業(yè)，現(xiàn)主要從事生物活性天然產(chǎn)物方面的研究工作。