劉慧敏，常洪濤，賀秀媛，陳 陸，楊 霞，王新衛(wèi)，李永濤，趙 軍，王川慶

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家養(yǎng)野豬源EMCV VP1基因的原核表達(dá)及其間接ELISA方法的建立和應(yīng)用

劉慧敏1，常洪濤2，賀秀媛2，陳 陸2，楊 霞2，王新衛(wèi)2，李永濤2，趙 軍2，王川慶2

目的 以原核表達(dá)的腦心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作為檢測抗原，建立間接ELISA方法用來檢測EMCV抗體。方法 應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-28a構(gòu)建家養(yǎng)野豬源EMCV VP1基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并在感受態(tài)細(xì)胞BL21中表達(dá)，將該重組蛋白純化后作為包被抗原，建立間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測程序，并應(yīng)用于臨床檢測。結(jié)果 經(jīng)雙酶切、PCR和測序鑒定，重組質(zhì)粒pET-28a-VP1構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)化后誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析得到高效表達(dá)的VP1蛋白，該重組蛋白可被EMCV陽性血清特異性識別，具有良好的反應(yīng)原性；通過優(yōu)化反應(yīng)條件，確定抗原濃度為1.25 ug/mL、待檢血清以1∶80倍稀釋為最佳抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋度，5%脫脂乳作為封閉液，待檢血清的最佳作用時間為37 ℃作用60 min，酶標(biāo)抗體稀釋度的最佳工作濃度和最佳作用時間分別為1∶8 000和37 ℃ 30 min，底物最佳顯色時間為20 min，特異性強(qiáng)，敏感性較高，重復(fù)性良好；應(yīng)用該間接ELISA方法分別檢測河南省126個豬場送檢的1 618份血清和527份PCV-2抗體陽性血清，發(fā)現(xiàn)陽性場檢出率為65.87%，血清總陽性率為45.30%，不同規(guī)模和不同階段豬群均存在EMCV感染，中小型豬場的陽性率顯著高于規(guī)模化豬場，EMCV與豬圓環(huán)病毒2型的混合感染率高達(dá)75.14%。結(jié)論 應(yīng)用原核表達(dá)的重組VP1蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法可用于檢測EMCV抗體水平，臨床檢測結(jié)果填補(bǔ)了河南省EMCV血清流行病學(xué)監(jiān)測的空白。

腦心肌炎病毒；VP1蛋白；原核表達(dá)；間接ELISA；臨床檢測

腦心肌炎(Encephalomyocarditis，EMC)是由腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)引起的一種以腦炎、心肌炎和繁殖障礙為主要臨診特征的人畜共患傳染病[1]。EMCV為單股正鏈RNA病毒[2]，全長約7.8 kb，結(jié)構(gòu)蛋白VP1處于病毒粒子最表面，是最重要的中和性抗原表位所在區(qū)域，受選擇性壓力的影響，需要不斷發(fā)生變異以維持病毒存活，并與病毒粒子表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、受體吸附及脫殼有關(guān)[3]。盡管當(dāng)前國內(nèi)并未發(fā)生嚴(yán)重疫情，但已證實(shí)多個省市豬場中存在感染，只是抗體陽性率差異較大[4-7]。隨著近年來國際交往日益頻繁，加之國內(nèi)地理環(huán)境復(fù)雜，生物多樣性豐富，從而為EMCV的發(fā)生、傳播和流行提供了有利條件，受其威脅的危險性日趨嚴(yán)重。及時了解本地豬群中EMCV的感染狀況，對于有效防制該病和保障人類健康具有重大意義，而建立一種快速、準(zhǔn)確、特異和敏感的抗體檢測方法尤為關(guān)鍵。本試驗(yàn)旨在對所分離的家養(yǎng)野豬源EMCV JZ1202株的VP1基因進(jìn)行原核表達(dá)和鑒定，并以該重組蛋白作為包被抗原，建立可用于檢測血清中EMCV抗體的間接ELISA方法，為該病的診斷、免疫檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段，也為ELISA 抗體診斷試劑盒的研制奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、感受態(tài)細(xì)胞和表達(dá)質(zhì)粒 家養(yǎng)野豬源EMCV JZ1202株、大腸桿菌DH5α、感受態(tài)細(xì)胞BL21和原核表達(dá)載體pET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 血清 豬抗EMCV陽性血清、EMCV陰性血清以及豬其他重要病毒性疾病如豬瘟(CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬偽狂犬病(PR)、豬細(xì)小病毒病(PPI)和豬圓環(huán)病毒病(PCVD)的陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備。1 618份待檢血清由2013年11月至2015年3月間河南省126個豬場送檢。另有未免疫PCV-2疫苗的豬場送檢的527份血清，經(jīng)檢測為PCV-2抗體陽性。

1.3 主要試劑 Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)、羊抗鼠酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記)和DAB顯色試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(14.4～97.4 kDa)和PVDF膜均購自寶生物工程(大連)有限公司；其他常規(guī)試劑和分子生物學(xué)試劑均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 VP1基因的原核表達(dá)

1.4.1 pET-28a-VP1原核表達(dá)載體構(gòu)建

1.4.1.1 引物設(shè)計 利用Primer Premier 5.0軟件，參考EMCV BJC3 株全基因序列(GenBank登錄號：DQ464062)，設(shè)計可覆蓋完整VP1基因的一對特異性引物，并在上、下游引物分別引入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增片段為831 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成：

EMCV-VP1-F：5′-GAC GGA TCC GGG GTA GAA AAC GCT GAA AG-3′

EMCV-VP1-R：5′-GCC GAA TTC CTC TAG CAT CAA GAC TCC AG-3′

1.4.1.2 目的基因擴(kuò)增 取JZ1202株的細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用Trizol LS Reagent提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)片段的cDNA后進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s, 57 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、回收和純化。

1.4.1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒制備 將純化的VP1目的片段與原核表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行BamH I、EcoR I雙酶切、膠回收和連接。隨后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性菌落增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序，確定是否存在堿基的缺失、插入或突變，讀碼框是否移碼等，將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET-28a-VP1。

1.4.2 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-28a-VP1轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，均勻涂布于LB平板(Amp+)，培養(yǎng)12 h，挑取陽性重組菌的白色單菌落，再接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中，37 ℃ 200 rpm/min振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100比例接種LB液體培養(yǎng)基(Amp+)，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，至對數(shù)生長中期(OD600nm=0.5～1.0)，加入IPTG至終濃度1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，分別取樣0、4、6 h時的樣品1 mL，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版中SDS-PAGE試驗(yàn)方法[8]，稍加修改進(jìn)行檢測。

1.4.3 重組蛋白的純化 將IPTG誘導(dǎo)6 h的菌體置于冰浴條件下超聲裂解，至菌體較清亮為止，4 ℃ 12 000 rpm/min離心25 min，取沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時將該沉淀按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4.4 重組蛋白的Western blotting檢測 將純化蛋白作SDS-PAGE，采用濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，200 mA恒流，1.5 h～2 h；用含5%脫脂奶粉的TBS封閉轉(zhuǎn)印后的PVDF膜，室溫1～2 h；倒掉封閉液，加入PBS清洗PVDF膜3～5次，每次10 min；加入1∶2 000稀釋的EMCV陽性血清(一抗)37 ℃震蕩孵育1～2 h；棄一抗，TBST沖洗PVDF膜3～5次，每次10 min；加入1∶4 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ℃震蕩孵育1～2 h后，將PVDF膜取出用TBST充分清洗3～5次至潔凈；避光滴加DAB顯色液于PVDF膜，至出現(xiàn)清晰的特異性條帶，拍照。

1.5 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件優(yōu)化 應(yīng)用矩陣法將倍比稀釋的VP1重組蛋白包被后，加入不同稀釋度的待檢血清進(jìn)行ELISA，篩選P/N值最大的抗原濃度和血清稀釋度為最佳抗原包被濃度和血清最佳稀釋度；分別選擇0.1% BSA、5%脫脂乳和1%明膠進(jìn)行封閉，以篩選最佳封閉液；酶標(biāo)板包被抗原、封閉處理后，分別置于室溫和37 ℃下反應(yīng)30 min、45 min和60 min，進(jìn)行ELISA以確定待檢血清最佳作用時間；將酶標(biāo)抗體分別作1∶5 000、1∶8 000和1∶10 000稀釋，進(jìn)行ELISA以確定最佳工作濃度，再分別置于室溫和37 ℃下反應(yīng)30 min、45 min和60 min，進(jìn)行ELISA以確定最佳作用時間；酶標(biāo)抗體作用完成后，加入TMB顯色液，37 ℃避光條件下分別顯色10 min、20 min和30 min，進(jìn)行ELISA以確定底物最佳顯色時間；將20份經(jīng)中和試驗(yàn)判定為EMCV抗體陰性的血清，按上述已優(yōu)化的ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，計算出OD450值，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析獲得平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)。根據(jù)生物統(tǒng)計學(xué)原理，OD450值≥(X+3SD)時判為陽性，OD450值≤(X+2SD)判為陰性，介于兩者間判為可疑。分別取CSF、PRRS、PR、PPI和PCVD的陽性血清進(jìn)行間接ELISA，觀察是否存在交叉反應(yīng)，以判定其特異性，同時設(shè)立EMCV標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清對照；選取15份豬血清，分別應(yīng)用中和試驗(yàn)和間接ELISA進(jìn)行檢測，比較二者的最高檢出稀釋度和符合率，以評估其相對敏感性；分別使用同1批次和3個不同批次表達(dá)純化的VP1重組蛋白進(jìn)行包被，應(yīng)用間接ELISA對4份血清樣品和1份陰性血清進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和3次批間重復(fù)試驗(yàn)，計算變異系數(shù)，以評價其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

1.6 EMC血清流行病學(xué)調(diào)查 應(yīng)用所建立的EMCV抗體間接ELISA方法，分別檢測河南省126個豬場送檢的1 618份血清和527份PCV-2抗體陽性血清。

2 結(jié) 果

2.1 獲得原核表達(dá)抗原

2.1.1 VP1基因RT-PCR及構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增得到長為831 bp的目的片段，與預(yù)期相一致(圖1)。對重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP1進(jìn)行PCR鑒定時可獲得831 bp的擴(kuò)增條帶(圖2)。BanH I和EcoR I雙酶切時可切出約5 900 bp和831 bp的2個基因片段(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果表明插入的VP1 基因片段長度和序列準(zhǔn)確。

M：DL2000 DNA Marker；1：Positive control；2-3：VP1 gene；4：Negative control圖1 VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplication of VP1 gene

M：DL2000；1：Positive control；2-6：VP1 gene；7：Negative control圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid

2.1.2 誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE 各誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，大小與預(yù)期結(jié)果相符，表達(dá)量較大(圖4)。而且融合蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間延長而增加，于誘導(dǎo)后6 h達(dá)到高峰。進(jìn)一步分析顯示，該重組蛋白以不溶性包涵體存在。

1：DL15000 DNA Marker；2：recombinant plasmid；3：Empty plasmid；4：recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion；5：VP1 gene；6：DL1000 DNA Marker

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion

1-3: pET28a-VP1 induced with IPTG for 0, 4, 6 h；4: Protein molecular weight marker (kDa)

圖4 不同時間誘導(dǎo)表達(dá)VP1蛋白的SDS-PAGE鑒定

Fig.4 SDS-PAGE identification of expressed under induction with IPTG at different time

2.1.3 VP1重組蛋白得到純化 重組VPl蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE分析，得到高純度的目的蛋白(圖5)，測定濃度為5.0 mg/mL。

2.1.4 重組蛋白經(jīng)Western Blotting證明為VPl抗原特異性 將純化的重組蛋白濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，在約30.5 kDa處出現(xiàn)一條特異性反應(yīng)條帶(圖6)。表明VP1基因在大腸桿菌中被誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得的重組蛋白能被EMCV陽性血清所識別，發(fā)生特異性的免疫印跡反應(yīng)，說明具有良好的抗原反應(yīng)原性。

1: Unpurified soluble protein；M:Protein molecular weight Marker 2: Unpurified inclusion body protein；1-4: Collected liquid of inclusion body protein after column M: Protein molecular weight Marker；5: Elution collected liquid of inclusion body protein 圖5 重組VP1蛋白純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant VP1 protein

M: Protein molecular weight marker；1-2: Purified VP1 protein圖6 重組VP1蛋白Western Blotting檢測Fig.6 Identification of recomibant VP1 protein by WB

2.2 間接ELISA反應(yīng)條件 當(dāng)抗原濃度為1.25 ug/mL，待檢血清以1∶80倍稀釋時，P/N值最大，可確定為最佳抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋度；以5%脫脂乳作為封閉液時，P/N值最大，可選其作為封閉液；當(dāng)待檢血清在37 ℃作用60 min時，P/N值最大，可確定為最佳作用時間；當(dāng)酶標(biāo)抗體稀釋度為1∶8 000，作用時間為37 ℃ 30 min時，P/N值最大，可確定為最佳工作濃度和最佳作用時間；底物顯色20 min時，P/N值最大，可確定為最佳顯色時間；20份陰性血清中，OD450值最大為0.325，最小為0.094，平均值為0.208，標(biāo)準(zhǔn)方差為0.071 2，計算臨界值為：陽性為0.208+3×0.071 2=0.42，陰性為0.208+2×0.071 2=0.35，介于兩者之間判為可疑。5種豬病毒性疾病的陽性血清反應(yīng)后，OD450值均小于0.42，表明所建立的間接ELISA方法特異性良好，無交叉反應(yīng)；15份豬血清經(jīng)中和試驗(yàn)檢測出陽性4份，經(jīng)ELISA方法檢測出陽性5份，二者符合率為93%，表明所建立的間接ELISA方法敏感性較高；經(jīng)計算，批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為7.35%，批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為7.18%，表明所建立的間接ELISA方法重復(fù)性良好。2.3 EMC血清流行病學(xué) 對河南省126個豬場送檢的1 618份血清進(jìn)行EMCV抗體檢測(表1)，其中陽性檢出場為83個(65.87%)，陽性血清數(shù)為733份(45.30%)。種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的血清總陽性率分別為38.94%、50.43%、53.57%和56.27%。規(guī)?；i場總陽性率為41.87%，種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的陽性率分別為35.91%、46.38%、47.13%和52.08%；中小型豬場總陽性率為50.89%，種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的陽性率分別為43.62%、56.25%、60.49%和66.36%。調(diào)查結(jié)果顯示，河南省不同規(guī)模、不同階段豬群中均存在著嚴(yán)重的EMCV感染。527份PCV-2抗體陽性豬血清中，EMCV抗體檢測陽性率高達(dá)75.14%，提示二者混合感染極為普遍(表2)。

表1 不同規(guī)模豬群中EMCV抗體檢測
Tab.1 EMCV antibody detections in pig farms of different sizes

豬場Pigfarms母豬Sows公豬Boars后備豬ReserveSwine商品豬Commercialpigs合計Total規(guī)模化豬場Large-scalepigfarms血清數(shù)Serumnumber58269872651003陽性數(shù)Positivenumber2093241138420陽性率(%)Positiverate35.9146.3847.1352.0841.87中小型豬場Smallandmediumsizepigfarms血清數(shù)Serumnumber3764881110615陽性數(shù)Positivenumber164274973313陽性率(%)Positiverate43.6256.2560.4966.3650.89合計Total血清數(shù)Serumnumber9581171683751618陽性數(shù)Positivenumber3735990211733陽性率(%)Positiverate38.9450.4353.5756.2745.30

表2 PCV-2抗體陽性血清中EMCV抗體的檢測
Tab.2 EMCV antibody detection of the PCV-2 antibody positive serum

血清數(shù)Serumnumber陽性數(shù)Positivenumber陽性率(%)Positiverate(%)52739675.14

3 討 論

在EMCV結(jié)構(gòu)蛋白中以VP1抗原性最強(qiáng)，多作為靶目標(biāo)來制備診斷抗原和設(shè)計新型疫苗。大腸桿菌遺傳背景清晰，生長速度迅速，可根據(jù)試驗(yàn)要求對其進(jìn)行突變改造，并可穩(wěn)定、高效的復(fù)制或表達(dá)轉(zhuǎn)入的外源基因，近年來已在多種動物病原研究中得到廣泛應(yīng)用[9-11]，但針對家養(yǎng)野豬源病原體的原核表達(dá)研究的報道尚不多見。本試驗(yàn)首次應(yīng)用原核表達(dá)載體pET-28a成功構(gòu)建了家養(yǎng)野豬源EMCV VP1基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP1，并在感受態(tài)細(xì)胞BL21中得到高效表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blotting鑒定，所表達(dá)的重組蛋白大小約為30.5 kDa，有良好的抗原反應(yīng)原性，在IPTG 誘導(dǎo)6 h時，表達(dá)量最大，并主要以包涵體的形式存在，這與蓋新娜的研究相一致[7]，這可能與VP1蛋白的氨基酸組成或表達(dá)速度過快，易富集于胞漿等有關(guān)。

動物感染EMCV后可產(chǎn)生抗體，但病毒會隨著抗體的出現(xiàn)而逐步減少，尤其在感染中后期或康復(fù)期，在體內(nèi)幾乎檢測不到病毒，因此抗體檢測更具價值，不僅是流行病學(xué)調(diào)查的主要技術(shù)手段，也可用來輔助臨床診斷。血清中和試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于EMCV的免疫學(xué)檢測，特異性較高，但操作繁瑣。血凝抑制試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等在EMCV早期研究中發(fā)揮了重要作用，但均不利于大批量檢測和快速診斷。ELISA方法快速、靈敏、操作相對簡單和易標(biāo)準(zhǔn)化，從而適合用于EMCV實(shí)驗(yàn)室診斷和大規(guī)模普查，但目前尚無成熟的市售試劑盒。本試驗(yàn)以原核表達(dá)成功的VP1重組蛋白作為包被抗原，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)化檢測程序，特異性強(qiáng)，敏感性較高，重復(fù)性良好，可用于EMCV的流行病學(xué)調(diào)查和早期診斷。

近年來，隨著對EMC公共衛(wèi)生問題的日趨重視，國內(nèi)多個實(shí)驗(yàn)室開展了血清流行病學(xué)調(diào)查，并證實(shí)大部分省市豬群中普遍存在感染，但抗體陽性率差異較大。蓋新娜等(2005)首次證實(shí)我國13個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場的平均陽性率為75.84%，隨后劉亞蘭等(2009)檢測河北省31個規(guī)?；i場、陸文俊等(2011)檢測廣西地區(qū)豬場、樊得英等(2012)檢測甘肅省規(guī)?；i場的抗體陽性率分別為13.48%、91.47%和62.8%。應(yīng)用本試驗(yàn)所建立的間接ELISA方法，對河南省126個豬場送檢的1 618份豬血清進(jìn)行檢測，陽性場檢出率65.87%，血清總陽性率為45.30%，種母豬、種公豬、后備豬和商品豬的血清總陽性率分別為38.94%、50.43%、53.57%和56.27%，表明該省豬群中EMCV感染極為普遍。不同規(guī)模、不同階段豬群中均存在著嚴(yán)重的EMCV感染，中小型豬場的陽性率明顯高于規(guī)?；i場，這應(yīng)與其養(yǎng)殖環(huán)境惡化、鼠害泛濫、飼養(yǎng)者養(yǎng)殖理念落后以及引種混亂等有關(guān)。

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s:Chang Hong-tao,Email:ndcht@163.com;Wang Chuan-qing,Email:wchuanq@163.com

Development and application of indirect ELISA for detection of antibodies against encephalomyocarditis virus based on prokaryotic expression of VP1 protein

LIU Hui-min1, CHANG Hong-tao2, HE Xiu-yuan2, CHEN Lu2, YANG Xia2,WANG Xin-wei2, LI Yong-tao2, ZHAO Jun2, WANG Chuan-qing2*

(1.CollegeofLifeScience,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou, 450002,China;2.CollegeofAnimalMedicineandHusbandry,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou450002,China)

We developed an indirect-ELISA method to detect the antibodies against encephomyocarditis virus (EMCV) using the prokaryotic expression of viral protein 1 as antigen. VP1 gene of EMCV was amplified and cloned into the prokaryotic expression vector pet-28a to obtain the recombinant expressed plasmid, and then were transformed into competent cells BL21 for expression. The recombinant protein purified was used as antigen to develop the indirect-ELISA standard detection procedure for clinical application. Results showed that the recombinant expression plasmid pet-28a-VP1 was identified by double digestion, PCR and sequence analysis. They were transformed into competent cells for expression, and VP1 protein was highly expressed by SDS-PAGE analysis. The recombinant protein was recognized specifically by positive serum of EMCV, the optimal antigen concentration was 1.25 ug/mL, the optimal reaction condition of serum samples was 60min at 37℃, the optimal dilution concentration and time of antibodies labeled with enzyme was 1∶8 000 and 30 min at 37 ℃ respectively, and the optimal color time of substrate was 20 min. The indirect-ELISA method was with high specificity and sensitivity, and good repeatability. The survey results showed that the detection rate of positive farm was 65.87% , and total serum positive rate was 45.3% in Henan Province. EMCV infection existed in different size and stages pig farms, compared with large-scale ones, small and medium-sized had higher positive rate, moreover, mixed infection rates with PCV-2 as high as 75.14%. In conclusion, the developed indirect ELISA method based on recombinant VP1 protein as coating antigen is useful for the detection of the EMCV antibody in clinical samples，which filled the surveillance gap of serum epidemiological of EMCV in Henan Province.

encephalomyocarditis virus; VP1 protein; prokaryotic expression; indirect ELISA; clinical detection

河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計劃(No.14IRTSTHN015)和國家自然科學(xué)基金委(No.31272567)資助

常洪濤，Email：ndcht@163.com

王川慶，Email：wchuanq@163.com

1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；

2．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.009

R373

A

1002-2694(2016)08-0728-06

2015-08-16；

2016-01-18

Henan Province University Science and Technology Innovation Team Support program (No.14IRTSTHN015) and National Natural Science Foundation of China (No.31272567)