江華++++++張奕穎++++++尹素改++++++張小莉++++++馮黎++++++劉勝利++++++張秋萍

[摘要] 目的 探討熊果酸（UA）誘導人結腸癌細胞HT-29凋亡的作用機制。 方法 MTT法觀察UA對HT-29細胞增殖的抑制作用；熒光顯微鏡和流式細胞術觀察HT-29細胞的凋亡情況；Western blot檢測細胞色素c（cyt-c）、caspase-3及Livin蛋白的表達。 結果 UA對HT-29細胞具有明顯的的增殖抑制作用，并呈一定的濃度和時間依賴性；熒光顯微鏡觀察結果顯示，50 μmol/L的UA作用24 h后，較多細胞呈現出凋亡的特征性改變；流式細胞術檢測發(fā)現，UA可將HT-29細胞阻滯于G1期，隨著UA濃度的增高，細胞凋亡率也相應增加；Western blot結果顯示，UA作用24 h后，Livin蛋白和caspase-3酶原的表達逐漸降低，線粒體釋放的cyt-c逐漸增多，活化的caspase-3片段逐漸增加。 結論 UA對HT-29細胞具有明顯的增殖抑制作用，其機制可能與UA阻滯HT-29細胞的細胞周期、激活線粒體凋亡途徑以及下調凋亡抑制蛋白Livin的表達有關。

[關鍵詞] 熊果酸；人結腸癌細胞HT-29；凋亡

[中圖分類號] R735.3+5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis-inducing mechanism of ursolic aicd （UA） in human colon cancer cell HT-29. Methods The inhibitory effect of UA on the growth of HT-29 cells was evaluated by MTT assay. Apoptosis was determined by fluorescence microscopy and flow cytometry. The expressions of apoptosis-associated proteins including cytochrome c （cyt-c）， caspase-3 and Livin were assessed by Western blot analysis. Results UA inhibited HT-29 cell proliferation in a time- and dose-dependent manner. Fluorescent microscope indicated characteristics of apoptosis present in cells after UA-treated （50 μmol/L， 24 h）. Flow cytometry showed that UA inhibited HT-29 in G1 phase， and the apoptosis rate of HT-29 cell exposured to UA increased， corresponding to the concentration of UA. The inceasing of the release of cyt-c from the mitochondria and the activated fragment of caspase-3 were detected by Western blot， while the expression of procaspase-3 and Livin was decreased gradually. Conclusion UA can inhibit the proliferation of HT-29 cells effectively in vitro. The mechanism of above-mentioned phenomena may be related with the arrest effect of UA in the cell cycle of HT-29， activated mitochondrial apoptotic pathway， and down-regulating the expression of Livin.

[Key words] Ursolic acid； Human colon cancer cell HT-29； Apoptosis

熊果酸（Ursolic acid，UA），又叫烏蘇酸、烏索酸，它在自然界中存在廣泛，是熊果、白花蛇舌草、烏梅等多種植物的主要活性成分，具有多種生物學活性，包括護肝[1]、抗炎[2-3]、抗血管生成[4]、降血糖[5]以及抗腫瘤[6-8]等作用?，F在人們日益重視UA的抗腫瘤作用，它可以抑制腫瘤細胞的轉移、減少腫瘤血管的生成、誘導腫瘤細胞的凋亡等，但UA通過何種途徑誘導腫瘤細胞的凋亡尚不完全清楚。本實驗研究了UA對HT-29細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞HT-29購自北京大學；UA、胰酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、DMSO、Hoechst33258和碘化丙啶（PI）染料均購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HYCLONE公司；新生小牛血清購自杭州四季青有限公司；鼠抗人cyt-c單克隆抗體和鼠抗人caspase-3單克隆抗體均購自Neomarkers公司；鼠抗人Livin單克隆抗體購自Stratagene Corporation公司；Western blot試劑盒購自Kirkegaard Perry Laboratories公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱為美國NUAIRE公司產品；熒光酶標儀為TECAN公司產品，型號：GENiOS VA200；流式細胞儀為BECKMAN產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HT-29細胞，每2～3天傳代1次，用對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測UA對HT-29細胞的增殖抑制情況 將HT-29細胞調節(jié)濃度至5×104個/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，待其貼壁后加入UA，使終濃度分別為10、20、30、40、50 μmol/L，并設立不含UA（0 μmol/L）的對照組，每組設3個復孔，各組中DMSO的最終含量均為0.5%（V/V）。將96孔板放在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩混勻后用酶標儀在570 nm波長下檢測各孔的吸光值（OD值）。計算細胞增殖抑制率=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況 將HT-29細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，接種濃度為1.25×105個/mL，加入UA至終濃度為50 μmol/L，同時設立不含UA（0 μmol/L）的對照組。UA作用24 h后，0.25﹪胰酶消化，2000 r/min離心10 min收獲細胞，PBS洗滌，加入Hoechst 33258染液避光孵育10 min。離心棄上清，加入PI染液4℃孵育30 min，離心，PBS洗滌，滴片，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.4 流式細胞術（FCM）檢測細胞周期和細胞凋亡率 分別以0、20、30、40、50 μmol/L的UA作用于HT-29細胞24 h，胰酶消化，離心棄上清，冷PBS洗2次，用預冷的70%乙醇4℃固定過夜。離心棄固定液，冷PBS洗2次，棄上清，加入RNA酶（1 mg/mL）240 μL，37℃水浴箱中放置30 min，加入PI染液避光染色30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 將HT-29細胞以5×106個/mL濃度培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，加入UA使其終濃度分別為0、20、30、40、50 μmol/L作用24 h后，2000 r/min離心10 min，PBS洗滌，棄上液。分別加入100 μL蛋白裂解液裂解30 min，離心取上清，熒光酶標儀檢測蛋白濃度。各實驗組蛋白液與等體積上樣緩沖液混勻，煮沸3 min，以15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉印蛋白至硝酸纖維素膜。然后將其放在封閉液中封閉2 h，分別加入鼠抗人cyt-c單克隆抗體、鼠抗人caspase-3單克隆抗體和鼠抗人Livin單克隆抗體，4℃孵育2 h。TBS漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。TBS漂洗3次，用Western blot蛋白質印跡（ECL）檢測試劑盒檢測，并用圖像分析軟件分析蛋白條帶的光密度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UA對HT-29細胞的增殖抑制作用

MTT結果表明，UA對人結腸癌細胞HT-29具有增殖抑制作用，并呈現出明顯的劑量和時間依賴性（圖1）。直線回歸方程顯示，UA作用于HT-29細胞12、24、36、48 h，其IC50值分別為（52.73±1.50）、（43.23±1.94）、（37.39±1.69）、（32.04±1.16）μmol/L。

2.2 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況

熒光顯微鏡觀察結果顯示，50 μmol/L的UA作用于HT-29細胞24 h后，許多細胞呈現出凋亡的特征性改變，HT-29細胞內的染色質分布不均勻，呈濃染的塊狀或顆粒狀；而0 μmol/L的UA作用24 h后，HT-29細胞內的染色質分布比較均勻，呈均勻彌散的藍白色熒光。壞死細胞呈紅色熒光（圖2，封三）。

2.3 流式細胞術（FCM）檢測細胞周期及細胞凋亡率情況

細胞經不同濃度UA作用24 h后，隨著UA濃度的增加，G0/G1期細胞比例逐漸增高，S期細胞比例逐漸降低；流式細胞儀分析顯示，隨著UA濃度的增高，在G1期前出現亞二倍體峰（細胞凋亡峰）逐漸增高，與0 μmol/L UA比較，凋亡率差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表1、圖3。

2.4 Western blot檢測Livin、caspase-3、cyt-c蛋白表達情況

Western blot結果顯示，隨著UA濃度（0、20、30、40、50 μmol/L）的增加，Livin蛋白和caspase-3酶原蛋白表達逐漸降低，而從線粒體中釋放出來的cyt-c逐漸增多，活化后的caspase-3片段的表達也逐漸升高，與0 μmol/L UA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

UA在自然界中分布較為廣泛，具有多種多樣的生物學效應，其突出作用是抗腫瘤，它對多種致癌物有抵抗作用，并且對多種惡性腫瘤細胞具有明顯的細胞毒作用、誘導分化以及抗血管生成作用。因此，人們越來越重視UA的抗癌防癌作用。

本試驗研究了UA對于人結腸癌HT-29細胞的作用，細胞增殖抑制實驗表明從30 μmol/L起，UA開始較顯著地抑制HT-29細胞的增殖作用，并呈濃度和時間依賴性。

PI只能透過壞死的細胞膜與細胞核結合，因此在紫外光激發(fā)下壞死細胞呈紅色。而Hoechst 33258屬于脂溶性染液，可以通過完整的細胞膜與靶細胞的細胞核結合，在紫外光的激發(fā)下會發(fā)出藍白色熒光。若細胞核染色均勻一致，呈彌散的藍白色熒光，則是活細胞；若細胞核染色不均勻，呈現出濃染的塊狀或顆粒狀，則是凋亡細胞。本試驗中采用Hoechst 33258和PI染色，通過熒光顯微鏡觀察HT-29細胞的凋亡現象，發(fā)現在50 μmol/L UA作用下，比較多的HT-29細胞呈現出凋亡的改變，其細胞內染色質分布不均勻，在熒光顯微鏡下可看到熒光斑點形成，而0 μmol/L的UA作用24 h后，HT-29細胞的細胞膜完整，染色質分布均勻，呈彌散的藍白色熒光。在兩個濃度的UA作用下都可以觀察到表現為紅色熒光的壞死細胞。

通過FCM檢測發(fā)現，UA可以將HT-29細胞阻滯在細胞周期的G1期，具體表現為G0/G1期的細胞比例增加，而S期的細胞比例降低。隨著熊果酸濃度的增加，HT-29細胞的凋亡率也在逐漸升高，體現在HT-29細胞的凋亡峰逐漸增高。因此，UA對HT-29細胞的凋亡作用可能是通過影響HT-29細胞從G1期向S期轉變，從而將該腫瘤細胞阻滯在G1期，減少了HT-29細胞進入S期的數量，從而抑制了腫瘤細胞DNA的復制，并導致HT-29細胞凋亡。

研究表明，腫瘤的發(fā)生和失控性生長是細胞增殖和細胞凋亡兩個過程失衡的結果。參與細胞凋亡的通路有三條，線粒體通路[9]、死亡受體通路[10]和內質網通路[11]，而線粒體通路中細胞色素c（cyt-c）是關鍵的分子。當細胞受到損傷后，cyt-c從線粒體中釋放出來，與凋亡活化因子1（Apaf-1）結合，并且激活caspase-9的前體，再進一步激活caspase-3，引發(fā)caspase的級聯反應，而caspase活化以后又可以促進靶細胞內的線粒體釋放cyt-c，同時其降解底物后的產物可以引起線粒體通透性的改變從而導致靶細胞凋亡的發(fā)生[12-15]。

在細胞凋亡的過程中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）發(fā)揮著很重要的作用。根據caspase在細胞凋亡中的作用和N-末端的長度，可以將其分成為兩大類：一類是起始型caspase（initiator caspase），如caspase-8、caspase-9，它們可以激活下游的caspase；另一類為效應型caspase（effector caspase），如caspase-3、caspase-6、caspase-7，它們可以直接降解靶細胞內的相關功能蛋白，導致凋亡的發(fā)生。這些caspase都是以無活性的前體形式存在，需要相關的激活因子將其激活為活性形式后才能發(fā)揮作用[16]。

在機體內還存在有抗凋亡基因和其相關表達產物，凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）就是其中一類，它對于調節(jié)細胞凋亡具有重要的作用[17]，某些IAPs成員的異常高表達可以導致細胞的凋亡過程受阻，其中，Livin是近些年來發(fā)現的人類IAP家族的新成員[18]，它與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系[19-21]。研究證實，IAPs主要通過與特異性的caspase蛋白結合并抑制caspase蛋白的活性，從而阻斷凋亡的發(fā)生[22-23]。

本研究Western blot結果表明，UA作用24 h后，隨著藥物濃度的增加，15 kD處cyt-c的釋放增多，caspase-3酶原和Livin蛋白的表達降低，而活化后的caspase-3片段的表達逐漸增高。據此推測，UA有可能通過改變HT-29細胞內線粒體膜的通透性，促進cyt-c的釋放，釋放出來的cyt-c進而導致caspase-3的活化。同時，UA還可以下調HT-29細胞內Livin蛋白的表達，故UA有可能解除Livin蛋白對caspase-3的抑制作用。上述兩個過程均可以增強靶細胞內caspase-3的活化作用，而活化的caspase-3可以作用于HT-29細胞質中的相關細胞骨架蛋白，或者是作用于靶細胞內的DNA酶，引起DNA的斷裂，從而導致HT-29細胞凋亡。

綜上所述，在體外UA可明顯抑制HT-29細胞增殖，并誘導其凋亡，它的作用機制可能是通過下調HT-29細胞內Livin蛋白的表達，促進線粒體內膜中的cyt-c釋放到胞漿中，繼而激活caspase-3，導致靶細胞的凋亡，其具體分子機制還有待進一步研究。

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