程西永，呼曉賢，李海霞，董中東，任 妍，陳樹林，詹克慧，許海霞

(河南農業(yè)大學/小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002)

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低溫脅迫下小麥幼穗中差異表達蛋白質的鑒定

程西永，呼曉賢，李海霞，董中東，任 妍，陳樹林，詹克慧，許海霞

(河南農業(yè)大學/小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002)

為探究低溫脅迫下小麥幼穗中脅迫響應差異表達蛋白,采用IEF/SDS-PAGE雙向凝膠電泳及質譜技術,以低溫敏感品種SW601和低溫不敏感品種隴麥157為材料，對常溫生長、0 ℃低溫脅迫12 h和72 h 的幼穗全蛋白進行了分析。結果表明,在pH 4～7時,SW601和隴麥157各處理幼穗蛋白圖譜中均可重復檢測到800～900個有效蛋白質點；低溫脅迫12 h、72 h后，SW601和隴麥157中上調表達的蛋白點分別有120個和101個,下調表達的蛋白點分別有92個和60個。對2種脅迫處理下均差異表達且Ratio>2的54個蛋白點進行質譜分析,成功鑒定出43個差異蛋白。經數(shù)據(jù)庫搜索匹配和蛋白質鑒定，這43個差異蛋白分別屬于脅迫應激/防御相關蛋白、光合作用蛋白、蛋白代謝相關蛋白、碳水化合物代謝相關蛋白、信號傳導相關蛋白、能量產生和運輸相關蛋白和未知功能蛋白等7類蛋白。其中，抗壞血酸過氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶和胚胎后期發(fā)育富集(LEA)同源蛋白14-A等蛋白的表達量在低溫不敏感材料隴麥157中變化顯著,而在低溫敏感材料SW601中沒有表達,這可能與小麥幼穗在低溫逆境下的代謝調控和低溫敏感特性有一定關系。

小麥；幼穗；低溫脅迫；雙向電泳；脅迫響應蛋白

小麥是我國主要糧食作物之一，提高小麥產量對保證我國糧食安全具有重要意義。小麥生長過程中經常遭遇干旱、極端溫度(低溫和高溫)和高鹽等非生物脅迫，使小麥生長發(fā)育和代謝受到抑制,甚至導致植株死亡[1]。在各種非生物脅迫中,低溫對小麥產量的影響尤為突出,是制約小麥高產、穩(wěn)產的重要因素[2]。小麥發(fā)育進程中,低溫會影響穗部發(fā)育和結實，在二棱末期-雌雄蕊分化期遭遇低溫，會直接影響小麥的產量和品質[3]。近年來,黃淮麥區(qū)春季低溫發(fā)生頻率呈增加趨勢，探究小麥春季低溫受害機理,選育抗春季低溫能力較強的新品種,可有效降低“倒春寒”對小麥生產的危害。低溫逆境下,植物組織內部生理生化代謝和蛋白質表達都會發(fā)生變化。目前,雙向凝膠電泳和質譜技術是研究逆境脅迫下蛋白質組學的核心技術之一。Cui等[4]對漸進溫度處理下水稻幼苗葉片差異表達蛋白研究中,獲得60個與低溫誘導相關的差異蛋白點,質譜分析發(fā)現(xiàn)分子伴侶蛋白有利于提高植物的低溫耐受性。韓巧霞等[5]對-5 ℃冷凍處理1 d和3 d小麥葉片的全蛋白進行了分離,質譜鑒定發(fā)現(xiàn)與應激脅迫相關的抗壞酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶和LEA蛋白等在適應低溫脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。Cabane等[6]的研究表明，熱休克蛋白HSP70與大豆抗寒性密切相關。前人在油菜、菠菜、番茄、楊樹等植物中也鑒定出大量耐冷相關蛋白[7-8],這些蛋白通過感知逆境轉導信號,并通過信號轉導途徑中的關鍵轉錄因子來調控細胞內逆境脅迫響應蛋白的表達,從而響應脅迫條件下植物生長和代謝[9]。因此,尋找逆境脅迫響應相關蛋白對于提高植物的抗逆性具有重要意義。

目前,蛋白質表達的研究大多集中在植物葉片、根、莖、胚乳、花藥、花粉、種子等器官中，而關于低溫敏感期小麥幼穗受到低溫脅迫后差異蛋白的研究較少。本研究以低溫敏感和不敏感的兩個小麥品種為供試材料,采用IEF/SDS-PAGE雙向凝膠電泳技術，對常溫及低溫脅迫12 h和72 h的小麥幼穗全蛋白進行分離，利用質譜技術對差異表達蛋白進行分析和鑒定,旨在尋找小麥幼穗中與低溫脅迫誘導相關的差異蛋白,從蛋白質組學水平研究小麥幼穗的抗寒機理,以期為小麥抗寒育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗材料為低溫敏感品種SW601和低溫不敏感品種隴麥157,均由河南農業(yè)大學小麥遺傳育種研究室提供。

試驗于2013-2014年在河南農業(yè)大學科教園區(qū)試驗田進行。采用盆栽，盆直徑24 cm，高20 cm,底部各打6個小孔,每盆裝土10 kg左右,埋入土中,盆內土壤與大田持平。2013年10月10號播種,每個材料種植9盆,每盆定苗10株。2014年3月20日開始通過形態(tài)學觀察和鏡檢判斷幼穗的發(fā)育時期,幼穗發(fā)育至雌雄蕊分化期時,進行室內低溫脅迫處理。

低溫脅迫溫度設為0 ℃,處理時間為12 h和72 h,每個處理3次重復,以常溫條件下生長的幼穗材料為對照(CK)；低溫處理結束后,在冰上剝取小麥幼穗,并立即放入離心管中液氮速凍,-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥幼穗蛋白質的提取

采用TCA/丙酮沉淀法[10]進行蛋白質提取。取-80 ℃冰箱保存的雌雄蕊分化期小麥幼穗1 g，加入少量的PVPP和石英砂,在研缽中迅速研磨成細粉,加入5 mL預冷的10%(w/v)的TCA和0.07% DTT的丙酮溶液,-20 ℃沉淀過夜；4 ℃, 16 000 r·min-1離心30 min,棄上清液，沉淀中加入2 mL預冷的80%丙酮(含0.07% DTT),充分混合后,放在-20 ℃靜置過夜；4 ℃,16 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,洗滌沉淀,重復洗滌2～3次至蛋白為純白色；用純丙酮替代80%丙酮洗滌,沉淀后真空冷凍干燥成干粉,向蛋白干粉中加入裂解液[8 mol·L-1urea，2 mol·L-1Thisoua, 4% CHAPS(w/v),40 mmol·L-1DTT],25 ℃水浴2 h,期間振蕩數(shù)次,室溫14 000 r·min-1離心40 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱備用[11]。蛋白含量的測定參考Bradford法[12],用BSA(牛血清蛋白)標準品配制不同濃度蛋白溶液,繪制標準曲線。

1.2.2 幼穗全蛋白的雙向凝膠電泳

第一向等電聚焦(IEF)電泳：按照Bio-rad公司的電泳操作指南進行,采用pH 4～7、24 cm的膠條,根據(jù)已測蛋白濃度,取900 μg蛋白樣品和一定體積的緩沖液[8 mol·L-1urea,2 mol·L-1thisoua,4% CHAPS(w/v),40 mmol·L-1DTT、Bio-lyte pH 3～7]至總體積450 μL,在室溫20 ℃泡脹IPG膠條，12～14 h后進行等電聚焦,設置聚焦程序為250 v/30 min、500 v/90 min、1 000 v/2 h、9 000 v/5 h、9 000 v/99 000 Vh、500 v/12 h，采用50 uA電流進行電泳。

第二向SDS-PAGE凝膠電泳：第一向等電聚焦電泳結束后,將膠條放在平衡液I[6 mol·L-1urea,2%(w/v)SDS,20%(v/v)甘油,1.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.8),2%(w/v) DTT]中平衡15 min，平衡結束后潤洗膠條2～3 min，再放入平衡液II[6 mol·L-1urea,2%(w/v)SDS,20%(v/v)甘油,1.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.8),2.5%(w/v)碘乙酰胺]中平衡15 min,用鑷子將平衡結束的膠條轉移至12%的垂直SDS-PAGE凝膠中，加入少量低熔點瓊脂糖固定膠條，凝固后20 ℃水浴電泳，待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳，進行凝膠的固定、染色和脫色。

1.2.3 圖像掃描及差異蛋白點篩選

采用UMAX PowerLook 2100XL凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像,用PDQuest 7.3 software(Bio-Rad)軟件對圖像進行斑點檢測、背景扣除、凝膠匹配和差異蛋白點的定量分析。電泳重復3次，從各處理中選取一張質量高的膠圖進行PDQuest軟件分析，以常溫下SW601和隴麥157幼穗蛋白電泳圖為對照(CK),利用PDQuest軟件篩選低溫脅迫后蛋白表達豐度變化在2倍以上的差異蛋白點。

1.2.4 質譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索

將在2種低溫處理下均差異表達且Ratio>2的蛋白點用修剪過的Eppdorf槍頭挖出，置于盛有少量去離子水的1.5 mL離心管中，標記序號送往中國科學院上海生命科學研究所進行質譜分析，獲得肽指紋圖譜。檢測儀器型號為5800 MALDI-TOF/TOF/質譜儀，檢測方式為正離子反射模式。質譜鑒定結果利用MASCOT(http://www.matrixscience.com)網站的相關軟件，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得差異蛋白的種類等相關信息。

1.2.5 差異蛋白質功能鑒定和分類

鑒定成功的蛋白質利用UniProt(http://www.ebi.uniprot.org)軟件來確定其功能，利用COG(cluster of orthologous groups of proteins)功能分類軟件進行功能分類。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下小麥幼穗差異表達蛋白分析

采用雙向電泳技術對CK和低溫脅迫12 h、72 h的小麥幼穗全蛋白進行分離(圖1)。利用PDQuest software(Bio-Rad)軟件對圖像進行蛋白點匹配和檢測，在CK和低溫脅迫12 h、72 h的SW601和隴麥157的幼穗中均檢測到800～900個有效蛋白質點。與CK對比發(fā)現(xiàn)，SW601和隴麥157中分別有41個和52個蛋白點在低溫脅迫12 h和72 h后均呈差異表達，其中Ratio>2的蛋白點分別有23個和31個。利用MALDA-TOF-MS技術對Ratio>2的蛋白點進行質譜分析和蛋白質鑒定，在SW601和隴麥157中分別成功鑒定出18個和25個蛋白點(表1和表2)。

從表1可以看出，低溫脅迫處理后,隴麥157中上調表達的蛋白點為抗壞血酸過氧化物酶(點17、18)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(點19)、胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白14-A(點13、14)、T-complex蛋白1γ亞基(點1)、T-complex蛋白1亞基(點4)、1,6-二磷酸果糖轉移酶β亞基(點2)、5-同型半胱氨酸甲基轉移酶(點3)、40S核糖體蛋白(點15)、烯醇化酶(點5)、 2,3-二磷酸甘油酸不依賴甘油酸變位酶(點6)、蛋白酶β亞基type-7-A(點22)和細胞周期依賴性蛋白激酶(點23)。表達量下調的蛋白點為真核轉運起始因子4A-1(點7)、蛋白質二硫鍵異構酶TaPDIL1-1(點9)、放氧增強蛋白(點16)、β-微管蛋白5、1、3(點10、11、12)、Rubisco大亞基(點24)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(點25)和磷酸丙糖異構酶(點20、21)。

從表2可以看出，低溫脅迫后，SW601中上調表達的蛋白點為谷胱甘肽S-轉移酶(點33)、冷休克主導蛋白2(點30)、α-1,4-葡聚糖蛋白合酶(點38)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(點39)和14-3-3蛋白(點32)。表達量下調的蛋白點為40S核糖體蛋白(點26)、亞精胺合酶1(點27)、真核轉運起始因子3亞基(點28)、核酮糖二磷酸羧化酶α亞基結合蛋白(點29)、核酮糖二磷酸羧化酶β亞基結合蛋白(點31)、70 kDa熱激同源蛋白1(點43)、烯醇化酶(點34、35)、胞質3-磷酸甘油酸激酶(點36)、異檸檬酸脫氫酶(點41)和ATP合成酶CF1α亞基(點42)。

隴麥157中的蛋白點17和18(抗壞血酸過氧化物酶)、13和14(胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白)以及SW601中的蛋白點34和35(烯醇化酶),這些蛋白點雖然在同一塊凝膠的不同位置，但卻具有相同的分子量(Mr)和PI值,質譜鑒定結果顯示為同一種蛋白質。

a、b、c分別代表CK和低溫脅迫12 h、72 h的隴麥157幼穗2-DE圖譜；d、e、f 分別代表CK和低溫脅迫12 h、72 h的SW601幼穗2-DE圖譜。

a, b, c represent the 2-DE map of Longmai 157 spike with low temperature for 0 h, 12 h and 72 h,respectively; d, e, f represent the 2-DE map of SW601 spike with low temperature for 0 h, 12 h and 72 h,respectively.

圖1 低溫脅迫下隴麥157和SW601幼穗蛋白質雙向凝膠電泳圖譜

表2 低溫脅迫下SW601幼穗差異蛋白點質譜分析結果

2.2 不同小麥品種幼穗差異表達蛋白的功能分析

低溫脅迫后，40S核糖體蛋白、烯醇化酶和真核轉運起始因子蛋白在2個小麥材料中(隴麥157 中蛋白點15、5、7，SW601中蛋白點26、34、35、28)均出現(xiàn)差異表達?？箟难徇^氧化物酶(蛋白點17和18)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(蛋白點19)和胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白(蛋白點13和14)等脅迫應激蛋白在隴麥157中的表達量發(fā)生了明顯變化,而在SW601中的CK和低溫處理圖譜中均沒檢測到這些蛋白質。冷休克主導蛋白2(蛋白點30)、70 kDa熱激同源蛋白1(蛋白點43)和谷胱甘肽S-轉移酶(蛋白點33)在SW601中發(fā)生了差異表達,而在隴麥157中則沒有檢測到(表1和表2)。

從差異表達蛋白的功能分類來看，低溫敏感材料SW601和低溫不敏感材料隴麥157 在蛋白種類和數(shù)量上均存在一定的差異。SW601中18個差異表達蛋白點的功能可以分為7類，其中碳水化合物代謝相關蛋白所占例最大(33.3%)，隴麥157中25個差異表達蛋白點的功能可以分為6類，蛋白質代謝相關蛋白所占比例最大(40%)。低溫脅迫后SW601中存在1個能量產生和運輸?shù)鞍缀?個光合作用相關蛋白,而隴麥157中不存在能量產生和運輸?shù)鞍?但增加了1個光合作用相關蛋白(3個)。

3 討 論

低溫脅迫下，植物的形態(tài)結構、生理生化代謝以及與脅迫相關蛋白質的表達均會發(fā)生變化，且植物抗寒能力高低與脅迫響應相關蛋白的合成和表達有直接關系。研究表明,參與蛋白合成、蛋白折疊和細胞壁合成有關的蛋白與水稻葉片對低溫的耐受性密切相關[5],蛋白表達量的變化與小麥自身耐冷性強弱有直接的關系[13]。

3.1 參與脅迫應激或防御的蛋白

低溫逆境下抗壞血酸過氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶的過量表達可有效清除環(huán)境脅迫下植物體內產生的ROS,提高植物抗逆性[14-15],LEA蛋白在低溫條件下具有保護細胞膜及維持蛋白質結構穩(wěn)定性的作用[16]。本研究結果表明，低溫處理后,抗壞血酸過氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶和胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白14-A在低溫不敏感材料隴麥157的幼穗中均上調表達,而在低溫敏感材料SW601幼穗中沒有表達。推測隴麥157中抗壞血酸過氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶參與了低溫脅迫下氧化應激反應,在清除H2O2和ROS中發(fā)揮了一定作用。

在低溫敏感材料SW601中鑒定出了熱激同源蛋白、冷休克主導蛋白2和谷胱甘肽S-轉移酶。熱激蛋白主要在動物疾病和寄生蟲中研究較多[17]，具有分子伴侶的功能，逆境脅迫下可形成具有一定空間結構的蛋白質，增強細胞對逆境脅迫的耐受性[18-19]。低溫脅迫可誘導植物中熱激蛋白(HSP70)的蛋白質合成。本研究中，低溫脅迫后敏感材料SW601中70 kD熱激同源蛋白下調表達,這可能與低溫敏感材料SW601中的熱激蛋白在低溫脅迫下蛋白質合成受到抑制有關。

3.2 參與光合作用的相關蛋白

光合作用對低溫最為敏感,低溫逆境下植物葉綠體光化學結構遭到破壞,光合速率下降,CO2的利用受阻, 同時可使光合系統(tǒng)中多種酶的活性受到抑制，從而影響光合作用過程中一系列電子傳遞系統(tǒng)[20-21]，最終導致核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)發(fā)生降解[22]。本研究中,隴麥157中鑒定出3個參與卡爾文循環(huán)的蛋白，分別為Rubisco 大亞基、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基和放氧增強蛋白；而SW601中僅鑒定出2個，即核酮糖二磷酸羧化酶亞基結合蛋白的α、β亞基。其中，Rubisco大亞基、Rubisco α、β亞基結合蛋白的亞基等都是光合作用過程中影響CO2固定的關鍵酶[23]。Santos等[24]通過對6 ℃低溫處理6 h、24 h的水稻葉片差異表達蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，Rubisco大亞基和Rubisco亞基結合蛋白大亞基的表達都下調，且降解加速。在本研究中，隴麥157和SW601中的5個光合作用相關蛋白在低溫脅迫12 h和72 h后均下調表達,這與Santos的研究結果基本一致,表明低溫脅迫下植物光合系統(tǒng)受到了破壞。

3.3 碳水化合物代謝相關蛋白

碳水化合物代謝主要控制糖的代謝、轉化及分配,磷酸丙糖異構酶是糖代謝過程的關鍵酶,在糖酵解途徑中發(fā)揮重要作用。研究表明,小麥在長期低溫馴化過程中磷酸丙糖異構酶會增加[25]。低溫脅迫下,烯醇化酶、2,3-二磷酸甘油酸不依賴磷酸甘油酸變位酶和磷酸丙糖異構酶等參與糖酵解途徑的蛋白，在低溫不敏感材料隴麥157中上調表達；而烯醇化酶、胞質3-磷酸甘油酸激酶和D-3-磷酸甘油醛脫氫酶則在低溫敏感材料SW601中下調表達。在糖酵解過程中，磷酸丙糖異構酶可將二羥丙酮磷酸轉變?yōu)楦视腿?3-磷酸，只有甘油醛-3-磷酸才可繼續(xù)進入糖酵解途徑。然而，SW601中沒有出現(xiàn)磷酸丙糖異構酶，可能與低溫脅迫下其表達量太低或其表達受到抑制有關，這將使SW601糖酵解途徑中糖代謝及能量產生和運輸無法順利進行，從而導致SW601糖代謝途徑相關蛋白酶的表達量下調，最終影響植物生長發(fā)育，使其抗性減弱。

3.4 蛋白代謝相關蛋白

蛋白質二硫鍵在二硫鍵及氨基酸支鏈的結合與形成方面發(fā)揮著重要作用[26]。低溫脅迫對植物核糖體蛋白的合成具有較大影響,在大豆中發(fā)現(xiàn)3個受低溫脅迫誘導的核糖體蛋白[27]。低溫脅迫下,40S核糖體蛋白SA在隴麥157幼穗中呈上調表達,而在SW601中則呈下調表達,這可能與參與蛋白質翻譯的核糖體蛋白在對低溫敏感度不同材料中的表達模式有關,上調表達可能有利于提高小麥幼穗抗低溫的能力。二硫鍵異構酶在隴麥157中下調表達,在SW601中沒有表達,這與Yan等[28]的研究結果基本相似。

3.5 能量運輸與信號轉導蛋白

ATP合酶是一種膜結合轉運蛋白,在葉綠體和線粒體能量轉換中可以催化ATP的合成和水解,進行跨膜質子運輸,同時緩解植物脅迫傷害[29]。信號轉導途徑中,14-3-3蛋白和某些蛋白激酶可以作為信號轉導中介，通過不同的關鍵轉錄因子協(xié)調逆境脅迫下細胞的正常代謝和響應[30]。

低溫脅迫處理后,SW601中的ATP合酶CF1α亞基表達下調,這可能與逆境脅迫下植物原生質結構遭到破壞,ATP的合成以及光合作用受到抑制有關。SW601中的14-3-3 蛋白和隴麥157中細胞周期依賴性蛋白激酶的表達豐度都有所增加,推測低溫脅迫下它們在信號轉導過程中通過調控耐冷相關基因表達而提高植物抗逆性方面發(fā)揮了一定作用。

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Identification and Analysis of Differentially Expressed Proteins in Wheat Young Spike under Cold Stress

CHENG Xiyong, HU Xiaoxian, LI Haixia, DONG Zhongdong,REN Yan, CHEN Shulin, ZHAN Kehui, XU Haixia

(Henan Agricultural University/National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Zhengzhou, Henan 450002, China)

In order to study the proteins responsing to low temperature(LT) in wheat(TriticumaestivumL.) spike, two varieties SW601(LT sensitive ) and Longmai 157(LT insensitive) were used to analyze the total protein profile under low temperature at 0 ℃ for 12 h and 72 h by two-dimensional electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry method,the spike under normal growth temperature conditions was control. The results show that there are 800 to 900 protein spots for each variety within pH 4 to 7. After 12 h and 72 h low temperature stress treatment,120 up-regulated and 92 down-regulated protein spots were found in SW601, while 101 up-regulated and 60 down-regulated protein spots were detected in Longmai 157. Fifty-four proteins spots which were significantly expressed with the expression ratio more than 2 under two temperature stress conditions were selected. There were 43 protein spots identified by mass spectrometry analysis.Using protein blast methods, the identified cold stress responsive proteins were classified into seven groups including stress/defense, photosynthesis, protein metabolism, carbohydrate metabolism, signal transduction, energy pathways and other unknown function. Some of the expressed proteins were enhanced significantly in LT insensitive varieties Longmai 157,such as ascorbate peroxidase,Cu/Zn superoxide dismutase,and late embryogenesis abundant,while they were not expressed in LT sensitive SW601.These protein may related to metabolic regulation or response characteristics of wheat spike under low temperature stress.

Wheat; Young spike; Low-temperature stress; Two-dimensional electrophoresis; Stress response protein

時間：2016-10-08

2016-03-12

2016-04-14

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2014CB138105)；河南省教育廳重點項目(15A180039)

E-mail：xyc634@163.com

許海霞(E-mail:hauxhx@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)10-1342-08

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.018.html