樸光一王曉明李華崔成哲金一

（1，延邊州農(nóng)業(yè)科學院 133002；2，延邊華龍集團 133002；3，延邊大學 133400)

嗜血支原體感染東方香豬動物模型的建立

樸光一1王曉明1李華2崔成哲1金一3*

（1，延邊州農(nóng)業(yè)科學院 133002；2，延邊華龍集團 133002；3，延邊大學 133400)

豬嗜血支原體也被稱為豬附紅細胞體，是寄生在豬血液內(nèi)，主要存在于紅細胞表面或游離于血漿及骨髓中而引起動物發(fā)病，發(fā)病仔豬主要以體溫升高、發(fā)生貧血、黃疸及母豬流產(chǎn)等癥狀為特征。本實驗研究以延邊州農(nóng)業(yè)科學院培育的東方香豬為實驗動物，通過注射地塞米松的方法降低其免疫力，然后以腹腔注射方式接種豬嗜血支原體，以建立嗜血支原體感染東方香豬的動物模型。

東方香豬；嗜血支原體；動物模型

東方香豬頭形似鼠，四肢細短，黑背白肚，體重多數(shù)不足10kg，原產(chǎn)海南省的五指山豬，體形小，肉質(zhì)細嫩、香味濃，是國際上珍稀的豬種之一。一些研究表明，東方香豬對豬巴氏桿菌、仔豬副傷寒等細菌病毒敏感性強，可用作復制動物模型，并在皮膚燒傷、移植，牙齒、口腔疾病模型，心血管模型等方面有所應用。豬嗜血支原體也被稱為豬附紅細胞體[1]，發(fā)病仔豬主要以體溫升高、發(fā)生貧血、黃疸及母豬流產(chǎn)等癥狀為特征。因為東方香豬容易感染豬嗜血支原體且癥狀明顯，適合作為嗜血支原體的動物模型。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

成年東方香豬10頭，其中雄性4頭，雌性4頭，妊娠母豬2頭。按不同年齡、不同性別無菌采集東方香豬抗凝血50份。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與處理

健康東方香豬10頭，經(jīng)鮮血壓滴標本和血液涂片，姬姆薩氏染色鏡檢及PCR方法檢測確定無豬嗜血支原體感染后，分為A、B、C、D、E5組，每組2頭，A、B、C3組試驗豬用免疫抑制劑處理，方法是注射地塞米松，劑量為每頭香豬每次注射地塞米松10mg，隔日注射1次，一直注射至試驗結(jié)束。D組不注射地塞米松，但是感染組。E組不做處理。

1.2.2 豬嗜血支原體陽性血液的采集與鑒定

血液樣本壓片鏡檢與染色，甲醇固定，按常規(guī)姬姆薩氏染色后鏡檢。判定標準用PCR檢測方法，血液標本PCR擴增后，將擴增產(chǎn)物通過凝膠成像儀觀察，若在541bp處得到單一的DNA條帶且條帶清晰明亮者為陽性，無特異性條帶者為陰性。血液壓滴標本鏡檢法，將每1份豬的血液壓滴標本置于高倍鏡下，觀察20個視野，觀察到嗜血支原體者為陽性，無嗜血支原體者為陰性；

1.2.3 人工感染試驗

用已經(jīng)計算嗜血支原體感染個數(shù)的陽性豬紅細胞作為感染香豬的標準樣品，感染方法注射地塞米松腹腔10.0ml/頭。

1.2.4 臨床癥狀觀察

東方香豬在感染嗜血支原體陽性豬紅細胞后，每天早9：00和下午4：00觀察體溫、呼吸、心率變化情況臨床表現(xiàn)并做好記錄。

1.2.5 香豬血液學檢查

感染后每天分別從各組香豬耳靜脈采血進行血液壓滴鏡檢和血液涂片染色鏡檢，連續(xù)觀察嗜血支原體的感染情況。

1.2.6 香豬血液樣本的PCR擴增

以感染陽性豬紅細胞作為0d，感染后第1天到第7天，每天分別從各組中的每頭香豬采血，從第7天以后，改為每隔2d采血1次，進行PCR擴增。

1.2.7 香豬血清中豬嗜血支原體抗體檢測

以感染陽性豬紅細胞當天0d，在感染后的第7、14、21、28、35天，分別從無菌采香豬血液約2ml，靜止離心保存-20℃冰箱中。用ELISA檢測抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 東方香豬群嗜血支原體感染情況

應用血液壓滴標本鏡檢法、血液涂片染色法和PCR方法對50頭份東方香豬血液樣本進行豬嗜血支原體感染情況檢測，具體檢測結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計學分析，血液壓滴標本鏡檢法與PCR檢測方法檢測的陽性率差異顯著 （0.01＜P＜0.05）。

表1 香豬嗜血支原體感染情況

由表2可見，各年齡段的豬均可感染嗜血支原體，但幼齡豬的易感性高于成年豬，其中1～5月齡的陽性率為72.7%，6～12月齡的陽性率為71.4%，12月齡以上的陽性率為63.6%，經(jīng)統(tǒng)計學分析，不同年齡段之間豬嗜血支原體的感染率差異不顯著 （P＞0.05）。

表2 PCR方法檢測不同年齡香豬嗜血支原體感染情況

2.2 試驗組香豬感染前檢查

2.2.1 血液壓滴標本檢查

經(jīng)對感染前香豬進行血液壓滴標本檢查，可見紅細胞呈正常形態(tài)。

2.2.2 姬姆薩氏染色檢查

經(jīng)對感染前香豬血液進行姬姆薩氏染色鏡檢，香豬紅細胞呈正常形態(tài)。

2.3 豬嗜血支原體陽性血液的鑒定

姬姆薩氏染色方法，被檢豬血液涂片，姬姆薩氏染色，油鏡觀察，可見嗜血支原體被染成淡紫色。

2.4 感染后東方香豬的臨床癥狀

感染豬嗜血支原體14d左右，A、B、C、D組東方香豬相繼表現(xiàn)出體表及可視黏膜蒼白，高熱達到42℃，厭食、反應遲鈍、消化不良等癥狀，個別豬黃疽，四肢特別是耳尖邊緣發(fā)紺。耳朵、頸下、胸前、腹下、四肢內(nèi)側(cè)等部位皮膚紅紫。出現(xiàn)便秘或拉稀，有時便秘和拉稀交替出現(xiàn)。個別豬后肢發(fā)生麻痹，不能站立，臥地不起。體溫、呼吸、心率變化見表3。E組東方香豬表現(xiàn)正常。

2.5 感染后香豬血液學檢查

2.5.1 血液壓滴方法檢查

香豬人工感染嗜血支原體后的第3～5天，經(jīng)血液壓滴標本檢查，可見紅細胞有嗜血支原體感染，其形態(tài)、大小與豬嗜血支原體相同。A、B、C3組試驗香豬在感染后的第5～7天紅細胞感染率達到80%，第9～12天紅細胞感染率相繼達到90%以上，第14天后感染率下降，但一直維持在75%左右；D組東方香豬嗜血支原體呈一過性感染；E組東方香豬無變化。

表3 嗜血支原體感染仔豬體溫、呼吸、心率變化情況（平均值）

2.5.2 姬姆薩氏染色檢查

試驗組香豬血液涂片，姬姆薩氏染色，油鏡觀察，可見嗜血支原體被染成淡紫色。

2.5.3 血常規(guī)檢查

感染后第7天采集各組香豬血液做血液常規(guī)測定，并應用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果見表4。

表4表明，各組東方香豬在感染豬嗜血支原體后，白細胞總數(shù)顯著升高 （P＜0.01），淋巴細胞總數(shù)、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白含量均顯著下降 （P＜0.05），紅細胞比容顯著下降 （P＜0.01）。

2.6 東方香豬血清中豬嗜血支原體抗體的檢測

將濃度為5μg/ml的豬嗜血支原體提純抗原包被于酶標板，待檢血清稀釋倍數(shù)為1：100，酶標二抗作濃度稀釋倍數(shù)為 1：4000，判定標準血清 OD405值≥0.18定為陽性，OD405值≤0.14定為陰性，0.14～0.18之間定為疑似。在感染后的第3、5、7、14、21天，采集每組東方香豬的血清，在上述條件下進行間接ELISA檢測，結(jié)果見表5。

從圖中可以看出，A、B、C3組東方香豬的抗體水平在感染第7天時達最高，D組香豬的抗體水平從3d開始直到21d時一直在升高。說明低免疫力影響東方香豬的抗體水平升高。

表5 東方香豬血清間接ELISA檢測結(jié)果

3 結(jié)論

（1）東方香豬可感染嗜血支原體，其感染率達70%。低免疫力的香豬在人工感染豬嗜血支原體后相繼表現(xiàn)出體溫升高，精神萎頓，食欲減退；可視黏膜蒼白、黃染，個別豬全身皮膚黃染；兩耳發(fā)紺，耳尖干燥。四肢內(nèi)側(cè)、胸腹下有大小不同的出血點和紫斑；有不同程度的嘔吐、腹瀉，消瘦，生長發(fā)育遲滯；體溫、呼吸、心率均有明顯變化，出現(xiàn)了豬嗜血支原體病典型臨床癥狀。

表4 試驗組東方香豬感染前后血液常規(guī)比較

（2）成功建立了嗜血支原體東方香豬動物感染模型。合適的感染劑量對動物模型建立非常重要，劑量小可能達不到所要求的感染率，而劑量太大則可能造成試驗動物死亡，因此感染劑量的多少直接影響到模型建立是否成功。

樸光一 （1966-)，男，高級畜牧師，研究方向：病原和分子生物學。

*通訊作者：金一，教授，主要從事分子生物學研究。