付強 許華明 陳秋玉 林志嫻 李鋒瑩 （佛山科學技術(shù)學院 528231）

豬源馬鏈球菌獸疫亞種的分離與鑒定

付強 許華明 陳秋玉 林志嫻 李鋒瑩 （佛山科學技術(shù)學院 528231）

從廣東省佛山市某養(yǎng)殖場患呼吸道疾病的生豬體內(nèi)分離到一株致病菌 （SSgd0511），通過細菌微量生化鑒定管、革蘭氏染色法鏡檢及16S rDNA基因序列分析鑒定該菌。結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陽性球菌，能利用乳糖、七葉苷、棉子糖、菊糖陽性；16S rDNA基因序列與BLAST比對，結(jié)果與馬鏈球菌獸疫亞種的同源性最高，表明本試驗分離得到一株馬鏈球菌獸疫亞種。

豬；馬鏈球菌獸疫亞種；鑒定

豬鏈球菌病是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要細菌性疾病，嚴重危害我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。我國豬鏈球菌的主要病原。我國豬鏈球菌病的病原主要包括豬鏈球菌2型 （Streptococcus suis serotype 2，SS2）和馬鏈球菌獸疫亞種 (Streptococcus equi ssp.Zooepidemicus， S.zooepidemicus)。S.zooepidemicus 屬于乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，能引起豬、馬、牛等多種動物發(fā)病，試驗動物小鼠、犬等對該菌也極為易感，在我國該菌主要引起豬鏈球菌病[1-3]?，F(xiàn)階段全面控制S.zooepidemicus感染仍然存在很多困難[4-5]，主要原因是對S.zooepidemicus的毒力因子和保護抗原的研究仍不夠深入。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

病豬來自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場，病豬主要表現(xiàn)為高熱，身體末梢皮膚紅紫，呼吸困難，糞便干硬，精神沉郁，跛行。

1.1.2 試劑

細菌微量生化鑒定管，購自廣東環(huán)凱生物有限公司；T4連接酶、DNA Marker、細菌DNA提取試劑盒和PCR相關(guān)試劑，購自寶生物工程 （大連）有限公司；UNIQ-10柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒、革蘭氏染色液，購自廣州瑞真生物有限公司；細菌16S rRNA基因引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；胰蛋白胨、LB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基購于廣州迪景生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離純化

無菌條件下從病豬的肺臟、關(guān)節(jié)液取樣，接種與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h。挑選優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，并接種于斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌的生化鑒定

用瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)并純化細菌，觀察其形態(tài)特征、菌落大小。并對純化的細菌進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)細菌微量生化鑒定管的說明書檢測該菌的生理生化指標。

1.2.3 16S rDNA序列分析

按試劑盒說明書提取SSgd0511的基因組序列，作為PCR擴增的模板，選用細菌16S rDNA通用引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、P2： 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系如表一所示。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性 5min，95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；共35個循環(huán)，72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple Vector載體進行連接并轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細胞，送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序。運用NCBI的BLAST程序?qū)⒌玫降?6S rDNA序列進行同源性比對，選取相似性較高的序列，采用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的特征

分離得到的菌株編號為：SSgd0511，接種單菌落到固體培養(yǎng)基，菌落直徑約1～3mm，灰白半透明，呈卵圓形；接種到液體培養(yǎng)基，菌體表面能形成莢膜；在綿陽血瓊脂平板呈β溶血。

2.2 分離菌的革蘭氏染色結(jié)果

分離菌通過革蘭氏染色，在顯微鏡下看到的是呈藍紫色的球形或卵圓形，排列成長短不等的鏈狀，表明本試驗的分離菌株SSgd0511屬于革蘭氏陽性球菌。

2.3 分離菌的生理生化特性

通過細菌微量生化鑒定管檢測分離菌株SSgd0511的生理生化指標，結(jié)果乳糖、七葉苷、棉子糖、菊糖呈陽性；VP、6.5%高鹽肉湯、pH9.6肉湯、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖、甘露醇、松三糖、D核糖、甘油、馬尿酸鹽呈陰性。

附表 PCR反應(yīng)體系

圖1 分離菌的革蘭氏染色結(jié)果

2.4 分離菌16S rDNA序列分析及發(fā)育樹

將測序得到的SSgd0511的16S rDNA序列與美國國家生物技術(shù)信息中心的序列進行BLAST分析，顯示與馬鏈球菌獸疫亞種的同源性為99%，從而確定此分離菌株SSgd0511為馬鏈球菌獸疫亞種，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，SSgd0511的16S rDNA序列與馬鏈球菌聚為一枝。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

豬鏈球菌病是當今危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要的細菌性疾病，嚴重危害著我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。外國研究人員Terri等通過對不同豬場進行抽樣檢查，發(fā)現(xiàn)最容易從扁桃體中分離鑒定到的細菌是豬鏈球菌[6]。研究人員Tang等對我國16省市2912例豬呼吸道疾病臨床樣本進行細菌分離鑒定[7]，豬鏈球菌的分離率最高，達到24.2%。我國研究人員Zhao等的研究同樣表明，豬鏈球菌病在我國處于豬細菌性疾病的首位[8]。我國豬鏈球菌病的病原主要包括豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種。馬鏈球菌獸疫亞種主要引起馬、豬、牛、狗、貓等多種動物下呼吸道感染，并引起敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎，肺炎以及突發(fā)性死亡等癥狀。S.zooepidemicus引起的豬鏈球菌病曾在我國華南、西南和華東等地區(qū)廣泛流行。1975年在四川省大面積爆發(fā)豬鏈球菌病，導致近百萬豬發(fā)病、30多萬豬的死亡。2007年廣西51個縣市又出現(xiàn)該病的大流行，經(jīng)濟損失慘重。直至現(xiàn)在，我國的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)仍受到豬鏈球菌病的影響。

S.zooepidemicus屬于乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，為革蘭氏陽性菌。在固體培養(yǎng)基中，該菌菌落直徑約1～4mm，灰白半透明，呈卵圓形，以短鏈的形式存在；在液體培養(yǎng)基中則可形成長鏈，菌體表面能形成莢膜；在綿陽血瓊脂平板呈β溶血，與本試驗分離菌株SSgd0511的特征基本一致。本試驗的病豬來自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場，病豬主要表現(xiàn)為高熱，身體末梢皮膚紅紫，呼吸困難，糞便干硬，精神沉郁，跛行，這些癥狀與S.zooepidemicus引起的豬鏈球菌病的癥狀基本一致。細菌微量生化鑒定結(jié)果乳糖、七葉苷、棉子糖、菊糖呈陽性；VP、6.5%高鹽肉湯、pH9.6肉湯、甘露糖、山梨糖、阿拉伯糖、甘露醇、松三糖、D核糖、甘油、馬尿酸鹽呈陰性，與豬鏈球菌的特征相似。進一步將分離株SSgd0511的16S rDNA序列與美國國家生物技術(shù)信息中心的序列進行BLAST分析，顯示與馬鏈球菌獸疫亞種的同源性為99%，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示SSgd0511的16S rDNA序列與馬鏈球菌聚為一枝，從而確定此分離菌株SSgd0511為馬鏈球菌獸疫亞種。

[1]Gruszynski K,Young A,Levine S J,et al.Streptococcus equi subsp.zooepidemicus infections associated with guinea pigs[J].Emerg Infect Dis,2015,21(1)：156-158.

[2]Velineni S,DeNegri R,Artiushin S C,et al.Comparison of specificities of serum antibody responses of horses to clinical infections caused by Streptococcus equi or zooepidemicus[J].Vet Microbiol,2015,180(3-4)：253-259.

[3]Watson J R,Leber A,Velineni S,et al.Recurrent Streptococcus equi subsp.zooepidemicus Bacteremia in an Infant[J].J Clin Microbiol,2015,53(9)：3096-3099.

[4]Yi L,Wang Y,Ma Z,et al.Identification and characterization of a Streptococcus equi ssp.zooepidemicus immunogenic GroEL protein involved in biofilm formation[J].Vet Res.,2016,47(1)：1-9.

[5]Tang F,Li D,Wang H,et al.Prophage lysin Ply30 protects mice from Streptococcus suis and Streptococcus equi subsp.zooepidemicus infections[J].Appl Environ Microbiol,2015,81(21)：7377-7384.

[6]O，Sullivan T,Friendship R,Blackwell T,et al.Microbiological identification and analysis of swine tonsils collected from carcasses at slaughter[J].Canadian Journal of Veterinary Research,2011,75(2)：106-111.

[7]Tang X,Zhao Z,Hu J,et al.Isolation,antimicrobial resistance,and virulence genes of Pasteurella multocida strains from swine in China[J].J Clin Microbiol 2009,47(4)：951-958.

[8]Zhao Z,Wang C,Xue Y,et al.The occurrence of Bordetella bronchiseptica in pigs with clinical respiratory disease[J].Vet J,2011,188(3)：337-340.

廣東省自然科學基金項目 （2014A030310020）；廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目 （2014KQNCX179）。

付強 （1983-），男，博士，講師，主要從事動物分子免疫學研究。