陳蔚軍 章薇 章翔

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

·論著·

YKL-40對MGMT高表達的人膠質(zhì)瘤干細胞“干性”的影響

陳蔚軍 章薇*章翔*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的研究YKL-40在MGMT高表達的人膠質(zhì)瘤干細胞(hGSCs)中對其干性的影響。方法收集臨床膠質(zhì)母細胞瘤樣本，行分離、培養(yǎng)并進一步鑒定為hGSCs。YKL-40慢病毒干涉后，采用單細胞克隆球形成實驗、BrdU細胞增值實驗檢測、RT-PCR法和Western blot法檢測hGSCs中干性表達及生物學(xué)功能的改變。結(jié)果所入圍的hGSCs中MGMT均為高表達，并且高表達YKL-40的hGSCs其單細胞成球能力、細胞增殖能力及干性表達均高于低表達YKL-40的hGSCs(Plt;0.05)。結(jié)論YKL-40在hGSCs干性維持的過程扮演了重要的角色，YKL-40有可能作為GBM手術(shù)后分子靶向治療的關(guān)鍵靶點，并作為臨床GBM診治提供新的思路。

膠質(zhì)母細胞瘤; 腫瘤干細胞; YKL-40; MGMT

膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)或高級別的膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計約占顱內(nèi)腫瘤的12%～15%[1,2]。通常，患者確診為GBM之后往往生存期較短。即便是經(jīng)過手術(shù)或放、化療等標準治療后，平均生存期大約也只能延長12～15個月[3]。最近的實驗研究已在GBM患者腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了一種特異性較強的細胞亞型，即：人膠質(zhì)瘤干細胞(hGSCs)，其在GBM的發(fā)生、發(fā)展及惡性表型中扮演著極為重要的作用[4]。hGSCs具有較強的自我更新及復(fù)制的能力，致使GBM容易復(fù)發(fā)[5,6]。導(dǎo)致hGSCs產(chǎn)生耐藥性的因素很多，最先發(fā)現(xiàn)的O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)的表達量和替莫唑胺(TMZ)的耐藥性有著密切的關(guān)聯(lián)[7,8]。YKL-40為一種分泌性的糖蛋白，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤患者血清及實體瘤組織中高表達[9]。研究表明，YKL-40在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲性過程中發(fā)揮了重要的作用[10,11]。然而我們對于hGSCs潛在的惡性表型機制及化療藥物抑制能力的認知還有限，本文重點研究MGMT高表達狀態(tài)下YKL-40表達水平對hGSCs干性的影響。對hGSCs分子生物學(xué)特性及表觀遺傳學(xué)的研究可能會在很大程度上推動對膠質(zhì)瘤的認知，并能有效地促進臨床治療的進步。

材料與方法

一、主要試劑與設(shè)備

胰酶(Trypsin)、脫氧核糖核酸酶I(DnaseI)、Neurobasal培養(yǎng)基、B27干細胞培養(yǎng)因子、N2干細胞培養(yǎng)因子、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及胎牛血清(Fetal bovine serum)均購于Gibco公司；細胞濾網(wǎng)(Nylon公司,美國)、YKL-40單克隆抗體、MGMT單克隆抗體、Nestin單克隆抗體、Olig2單克隆抗體、Vimentin單克隆抗體及β-tubulin單克隆抗體(R and D System公司,美國)、二抗(中衫金橋公司,中國)、RNAiso Plus(Takara公司,日本)、RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,美國)、SYBR?PremixExTaqTMII(Takara公司,日本)、熒光二抗、DAPI(Bio-Rad公司,美國)和Cell Proliferation ELISA、BrdU試劑盒(Roche公司,美國)。

二、方法

1.hGSCs的分離及培養(yǎng)：將手術(shù)切除的GBM腫瘤標本行機械性分割為2 mm大小的組織塊，加入適量Trypsin和10 U/ml的DNasel，在37℃孵箱中消化45 min。離心后經(jīng)數(shù)次HBSS清洗，經(jīng)過100 um的細胞濾篩過濾，將濾過后的細胞置于EF培養(yǎng)液(包含3 mmol/L L-Glutamine、1×B27 supplement、0.5×N2 supplement、2 ug/ml heparin、20 ng/ml recombinant human EGF、20 ng/ml recombinant human FGF、1×penicillin)中培養(yǎng)。

2.Western blot：收集各組hGSCs對照組及病毒組細胞，提取總蛋白。行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜條件為100 V，1.5 h。轉(zhuǎn)膜后用新鮮配制的5%脫脂奶粉于室溫下封閉90 min。加入山羊抗人YKL-40單克隆抗體(1∶250)、鼠抗人MGMT單克隆抗體(1∶1 000)、鼠抗人Nestin單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人OLIG2單克隆抗體(1∶500)、兔抗人Vimentin單克隆抗體(1∶1 000)及兔抗人β-tubulin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。棄去一抗后，1% TBST清洗，加入辣根過氧化物酶標記 (horseadish peroxidase-conjugated,HRP ) 的抗鼠、抗兔或抗山羊的二抗，室溫孵育1 h。TBST清洗后，加入發(fā)光液，成像拍照。

3.Real-time PCR：收集各組hGSCs及對照組與病毒組細胞，TRIzol法提取總RNA。將mRNA按First Strand cDNA synthesis Kit說明書步驟反轉(zhuǎn)為cDNA。Real-time PCR反應(yīng)條件為：起始變性 95℃ 3 min；變性 95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸 72℃ 45 s，循環(huán) 40 次；最后延伸 72℃ 10 min。所用引物序列如下：

human YKL-40 sense:5'-TGCAGCCAGAATGGGTGT-3',antisense:5'-CTGGTGTAGTAGCAGACCAGTTTGT-3';human CD133 sense:5'-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3',antisense:5'-CTCCGAATCCATTCGACGATA-3';human Olig2 sense:5'-TCGGAGCGAGCTCCTCAAAT-3',antisense:5'-GGGAAGATAGTCGTCGCAGCTT-3';human Vimentin sense:5'-TGACATTGAGATTGCCACCTACAG-3',antisense:5'-TCAACCGTCTTAATCAGAAGTGTCC-3'.human GAPDH sense 5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3'antisense 5'-TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG-3'.

上述引物均由上海寶生生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)。

4.細胞免疫熒光染色：將各組hGSCs按2×105/ml種植于多聚賴氨酸包被過的6孔板玻片上，加入EF培養(yǎng)液400 ul，24 h后膠質(zhì)瘤干細胞均粘附于玻片上，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗。經(jīng)4%的多聚甲醛(PFA)室溫固定15 min后，棄去多聚甲醛，PBS清洗。加入一抗稀釋液(含0.3%Triton-X100、5%BSA、一抗)，4℃孵育過夜。棄去一抗稀釋液，PBS清洗。加入熒光二抗，避光室溫孵育1 h，棄去二抗，PBS清洗。加入DAPI(1∶5 000)細胞核染色10 min，棄去DAPI染色液，PBS清洗?？勾銣鐒┓馄笥跓晒怙@微鏡下觀察并拍照。

5.YKL-40過表達及shRNA慢病毒包裝及感染hGSCs：將各組hGSCs克隆球分離為單個細胞后，取2×105單細胞種植于含2 ml的EF培養(yǎng)液6 cm皿中，加入適宜低度的病毒液和5 mg/ml的內(nèi)質(zhì)體，混合均勻后培養(yǎng)5～7 d，于3 d后加EF培養(yǎng)液0.5 ml，7 d后觀察熒光反應(yīng)，明確病毒感染效率。

6.單細胞克隆球形成實驗：將各組hGSCs克隆球分離為單細胞后，用紅細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)，以倍比稀釋法將原細胞懸液稀釋為1×103/ml，種植于96孔板中，每孔100 ul，每組8個復(fù)孔。7 d后添加EF培養(yǎng)液100 ul。14 d后鏡下計數(shù)單細胞克隆球的形成數(shù)量。

7.細胞增值實驗：將各組hGSCs克隆球分離為單細胞后，種植于96孔板中，每組3個復(fù)孔，每孔1×105個細胞并加入100 ul EF培養(yǎng)液。實驗過程均按Cell Proliferation ELISA,BrdU (colorimetric) Kit說明書操作，加入25 ul 1M H2SO4后終止反應(yīng)，經(jīng)酶標儀檢測450 nm波長處OD值。

8.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 13.0軟件包進行分析，兩組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析法，即one-way ANOVA進行差異性統(tǒng)計，使用Tukey檢驗進行組間檢驗、校正。所有數(shù)據(jù)比較，Plt;0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 克隆球染色
Fig 1 Staining of spheres
A:The spheres of human glioma stem cells (×200); B,C:The fluorescence staining of Nestin and CD133 (×400); D,E:The fluorescence staining of GFAP and Tubulin III after serum-induced differentiation ( ×400).

圖2 人膠質(zhì)瘤干細胞中MGMT的表達量
Fig 2 The expression of MGMT in human glioma stem cells

圖3 人膠質(zhì)瘤干細胞病毒組與對照組中細胞增值能力比較
Fig 3 Comparison of the cell proliferation ability between virus and control groups

aPlt;0.05,vscontrol groups.

圖4 人膠質(zhì)瘤干細胞病毒組與對照組中干性表達比較
Fig 4 Comparison of the stemness between the virus and the control groups

A：The expression of mRNA between the virus and the control groups； B：The blot image of the expression of stemness between virus and control groups

aPlt;0.05,vscontrol groups.

結(jié) 果

一、hGSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

將臨床上收集的hGSCs組織標本進行分離、培養(yǎng)。在適宜于膠質(zhì)瘤干細胞分選的培養(yǎng)條件下，7 d內(nèi)腫瘤組織標本可以形成典型的神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)。成功分離、培養(yǎng)了三株可穩(wěn)定傳代超過6個月的hGSCs。經(jīng)細胞免疫熒光染色表明，此三株腫瘤干細胞皆表達Nestin及CD133。加入10%的血清后，神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)分化為貼壁細胞、且表達膠質(zhì)細胞活化的典型標志物GFAP及神經(jīng)元的典型標志物tubulinIII。上述結(jié)果證明，從腫瘤組織樣本中分離、培養(yǎng)的神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)即為腫瘤干細胞，并具有多向分化潛能(圖1)。

二、hGSCs中MGMT蛋白表達水平

用Western blot 法檢測三株hGSCs中MGMT蛋白的表達水平，結(jié)果表明，WZ12、WZ27、WZ31均為MGMT陽性表達(圖2)。因而，將此三株hGSCs作為我們選擇的研究對象。

三、慢病毒感染后對hGSCs單細胞克隆球形成能力的影響

分別檢測了原代、第二代、第三代的各株hGSCs病毒組與對照組單細胞克隆球形成能力。結(jié)果顯示，WZ12在上調(diào)YKL-40后、其克隆球形成能力有所增強(Plt;0.05)；而在WZ27和WZ31這兩株hGSCs中，當YKL-40下調(diào)后、其克隆球形成能力明顯減弱(Plt;0.05)。

四、慢病毒感染后對hGSCs體外增值能力的影響

各hGSCs病毒組與對照組的Brdu實驗結(jié)果顯示(圖3)：WZ12過表達YKL-40后，其增值能力提高(Plt;0.05)；而WZ27、WZ31敲除YKL-40后，其增值能力則降低(Plt;0.05)。

五、慢病毒感染后對hGSCs干性的影響

RT-PCR實驗檢測了病毒感染各株hGSCs后干性指標CD133、Vimentin、olig2的變化(圖4A)表明：WZ12病毒感染后、其干性指標均升高(Plt;0.05)；WZ27、WZ31病毒感染后、其干性指標均下降(Plt;0.05)。Western blot實驗同時檢測了hGSCs感染病毒后干性指標Nestin、Vimentin、olig2的改變(Plt;0.05)(圖4B)提示：其干各株hGSCs干性指標的變化與RT-PCR的結(jié)果一致。

討 論

干細胞和腫瘤細胞都具有這樣自我更新的特性。干細胞的干性主要表現(xiàn)為細胞的自我復(fù)制和多項分化潛能，這種能力維持了細胞的繁衍以及多樣性[12]。然而在GBM中，hGSCs因其自我更新、多項分化及藥物抑制性等特點，在基礎(chǔ)和臨床研究中廣受重視。hGSCs干性的維持是其上述特性的基礎(chǔ)。在常規(guī)的GBM治療中，我們只是針對實體的腫瘤，寄希望于盡可能的將腫瘤切除干凈或應(yīng)用放、化療以縮小腫瘤體積，但是往往忽略了腫瘤來源的根本。如果不能有效地抑制hGSCs的作用，很可能會導(dǎo)致GBM的迅速復(fù)發(fā)。YKL-40作為一多種屬來源、高度保守的蛋白，參與了細胞的增殖、分化、凋亡、血管生成及組織重構(gòu)等過程。其表達水平與腫瘤的分級呈正相關(guān)，并參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的演進過程。最新研究表明，YKL-40在腫瘤干細胞干性維持等生物學(xué)特性中發(fā)揮了重要作用。在本研究中，為明確YKL-40對GSCs干性的作用，我們應(yīng)用shRNA慢病毒感染的方法，下調(diào)或上調(diào)hGSCs中YKL-40的表達量，體外實驗中證實了hGSCs的“干性”與YKL-40的表達水平呈正相關(guān)關(guān)系。本研究證明了YKL-40在hGSCs干性維持的過程中扮演了重要角色。YKL-40可能作為GBM手術(shù)后分子靶向治療的關(guān)鍵靶點及成為GBM判斷預(yù)后的指標之一。MGMT系一種DNA修復(fù)蛋白，它可以直接通過將烷基化的結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移至其內(nèi)在的半胱氨酸殘基的活化位點上，從而恢復(fù)O6烷基化鳥嘌呤位點結(jié)構(gòu)的完整性?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的證據(jù)顯示，MGMT的表達量主要受表觀遺傳學(xué)中的啟動子之甲基化調(diào)控。通常情況下，涵蓋MGMT基因啟動子和外顯子較多部分的CpG島是處于甲基化狀態(tài)的[13,14]，但是在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細胞、尤其是hGSCs中，CpG島中的胞嘧啶發(fā)生去甲基化，進而導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄因子的過度結(jié)合，最終使MGMT蛋白表達量升高，以及瘤細胞對烷化劑化療藥物敏感性降低。本實驗是基于MGMT高表達的hGSCs為研究對象的，而MGMT低表達狀態(tài)下YKL-40對hGSCs的調(diào)控作用又是如何？尚需進一步研究。

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EffectofYKL-40onthe"stemness"ofhumangliomastemcellswithhighexpressionofMGMT

CHENWeijun,ZHANGWei,ZHANGXiang

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032,China

ObjectiveThe effect of YKL-40 on the stemness of human glioma stem cells (hGSCs) with high expression of MGMT was investigated.MethodsThe hGSCs were isolated and identified from clinical glioblastoma specimen. After confirming the transduction effect of hGSCs with YKL-40 lentivirus,single cell sphere formation assay,cell proliferation assay,RT-PCR and Western blot analysis were used to detect the expression of "stemness" markers and the changes of biological function in hGSCs.ResultsMGMT protein was highly expressed in all the selected hGSCs. Single cell formation,cell proliferation and "stemness" of hGSCs with highly expressed YKL-40 were better than those of hGSCs with lower expression of YKL-40.ConclusionYKL-40 plays an important role in the process of "stemness" maintenance,and it might be the key target for the molecular therapy after clinical surgery,however,it can also provide new clinical ideas for the diagnosis and treatment of glioblastoma multiforme.

Glioblastoma multiforme; Cancer stem cell; YKL-40; MGMT

1671-2897(2016)15-309-04

R 739

A

國家自然科學(xué)基金資助項目( 81302174)

陳蔚軍，博士研究生，E-mail：chenweijun0920@126.com

*通訊作者：章薇，講師、主治醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師，E-mail:nuomi_weiwei@126.com；章翔，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師， E-mail：xzhang@fmmu.edu.cn

2016-06-07；

2016-07-20)