黃世品，吳志鵬，梁勇

（廣東省東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞523086）

應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)牛結(jié)核分枝桿菌Y-干擾素

黃世品，吳志鵬，梁勇

（廣東省東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞523086）

為了驗(yàn)證ELISA方法檢測(cè)牛結(jié)核分枝桿菌Y-干擾素的可行性，應(yīng)用建立的ELISA方法檢測(cè)30份牛全血，結(jié)果為陰性和陽(yáng)性對(duì)照均成立，30份全血的牛結(jié)核分枝桿菌Y-干擾素均為陰性，結(jié)果表明應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)牛結(jié)核分枝桿菌Y-干擾素診斷牛結(jié)核分枝桿菌可行，可以適用于牛結(jié)核分枝桿菌的大規(guī)模監(jiān)測(cè)。

結(jié)核分枝桿菌；牛；ELISA；Y-干擾素；血清學(xué)

結(jié)核（tuberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的一種重要的人畜共患病在世界各國(guó)均有發(fā)生，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康具有很大的威脅。結(jié)核病在動(dòng)物檢疫中具有很重要的意義，目前我國(guó)牛結(jié)核病的檢疫方法主要是牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，該方法存在費(fèi)事，受外界干擾因素多等缺點(diǎn)。1989年Wood等建立了一種簡(jiǎn)單的體外檢測(cè)方法，其原理是基于血液T淋巴細(xì)胞對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌PPD的細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)核菌素PPD抗原遞呈到全血組織培養(yǎng)物的淋巴細(xì)胞后，感染牛結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞就能產(chǎn)生Y-干擾素，并通過(guò)基于單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)到。未感染牛結(jié)核分枝桿菌的淋巴細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生Y-干擾素，因此，Y-干擾素的檢測(cè)與牛結(jié)核分枝桿菌感染相關(guān)。目前，體外Y-干擾素的檢測(cè)方法已被澳大利亞、新西蘭和歐美等國(guó)家批準(zhǔn)為正式試驗(yàn)方法，并且為OIE推薦的方法。本次研究利用建立Y-干擾素ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)活牛交易市場(chǎng)的牛，驗(yàn)證該方法的可行性，為牛結(jié)核的檢疫和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1牛全血30份牛全血，采自東莞市橫瀝鎮(zhèn)活牛交易市場(chǎng)，用頸靜脈采血，加入肝素抗凝劑，顛倒幾次混勻血液，使肝素溶解。在室溫下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，并在30h內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2試劑和儀器牛結(jié)核分枝桿菌Y-干擾素試劑盒：購(gòu)自瑞士BOVIGAM，批號(hào)：6332900701；牛型結(jié)核菌素，購(gòu)自BOVIGAM，批號(hào)：63314017001；禽型結(jié)核菌素，購(gòu)自BOVIGAM，批號(hào)：6331301701。SUNRISE酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司。

1.3方法

1.3.1全血培養(yǎng)將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭動(dòng)物加3管1.5mL分裝的抗凝血，分別無(wú)菌加入100μLPBS（陰性抗原對(duì)照）、禽型PPD、牛型PPD至相應(yīng)的孔，用微量振蕩器震蕩1min，放在濕盒37℃培養(yǎng)16～24h。

1.3.2血漿樣品的收集孵育后小心吸取約500mL的上層血漿放入儲(chǔ)存管中，待檢，盡量避免吸入紅細(xì)胞。

1.3.3ELISA方法

1.3.3.1使用前，所有的試劑組分回復(fù)到室溫（21℃+/-5℃），加入50μL稀釋液至所需的孔，加入50μL待測(cè)樣品和陰性、陽(yáng)性對(duì)照至相應(yīng)的孔，震蕩混勻，室溫孵育60min。

1.3.3.2倒掉板中液體室溫洗滌6次，排干，加入100μL配制的酶標(biāo)結(jié)合物，室溫孵育60min。

1.3.3.3倒掉板中液體室溫洗滌6次，排干，加入100μL底物，室溫避光孵育30min。

1.3.3.4加入50μL終止液，450nm波長(zhǎng)讀數(shù)。

1.3.3.5結(jié)果有效性。

牛Y-干擾素陰性對(duì)照小于0.13，重復(fù)孔差值不能大于0.04；牛Y-干擾素陽(yáng)性對(duì)照大于0.7，重復(fù)孔OD值變化幅度不超過(guò)平均OD值得30%，結(jié)果成立。

1.3.3.6結(jié)果判定。

牛PPD的OD值減去陰性抗原的OD值大于等于0.1且牛PPD的OD值減禽PPD的OD值大于等于0.1判為陽(yáng)性。牛PPD的OD值減去陰性抗原的OD值小于0.1或牛PPD 的OD值減禽PPD的OD值小于0.1判為陰性。

2　結(jié)果

結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照平均OD值為1.02，陰性對(duì)照平均OD值為0.02，結(jié)果成立，檢測(cè)30份牛全血，牛結(jié)核分枝桿菌結(jié)果均為陰性，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

3　討論

本次試驗(yàn)采用建立的Y-干擾素ELISA檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果成立，對(duì)采自活牛交易市場(chǎng)的30頭牛檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果表明該方法可行，適用于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)，活牛交易市場(chǎng)的牛未發(fā)現(xiàn)有結(jié)核病陽(yáng)性可能與采集的樣品比較少有關(guān)，在以后試驗(yàn)加大樣品的檢測(cè)量。

牛結(jié)核病的診斷方法目前主要有三類：細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定、免疫學(xué)方法和細(xì)菌的核酸檢測(cè)。其中細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定是結(jié)核桿菌的確診方法，但是分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)菌分離率低，需要在一定生物安全防護(hù)措施的實(shí)驗(yàn)室才能操作，并且需要采集組織樣品，不適合活牛的檢疫。細(xì)菌的核酸檢測(cè)，靈敏度高，特異性好，需要PCR儀或熒光PCR儀，不利于基層的檢疫。在我國(guó)的結(jié)核病檢疫中主要采用牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)，但該方法存在較多假陽(yáng)性，需進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，試驗(yàn)需要3d時(shí)間，受外界的干擾因素比較多，對(duì)操作人員要求也比較高，需要一定的檢疫經(jīng)驗(yàn)。采用牛體外Y-干擾素來(lái)判斷牛結(jié)核的感染，敏感性和特異性均高于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。體外Y-干擾素檢測(cè)方法與頸部皮試變態(tài)反應(yīng)相比,可以排除一部分禽結(jié)核陽(yáng)性的牛,特異性高，在牛結(jié)核病診斷中，除了常規(guī)皮試變態(tài)反應(yīng),體外Y-干擾素來(lái)判斷牛結(jié)核是最有應(yīng)用價(jià)值和前景的檢測(cè)方法。

表1　牛分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用Y-干擾素檢測(cè)方法進(jìn)行牛結(jié)核病的檢疫，不但可以提高牛結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性，還可以提高檢測(cè)的速度。在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，可以把皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和體外Y-干擾素檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)。在對(duì)牛進(jìn)行牛結(jié)核檢疫時(shí)，先采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的牛即采取隔離措施，然后采用Y-干擾素檢測(cè)方法進(jìn)一步檢測(cè)，兩種檢測(cè)方法均為陽(yáng)性的牛給予淘汰，養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)過(guò)多次的淘汰，最終達(dá)到牛結(jié)核病的凈化目的。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．10.022