蔣美卿　許曉路　張德勇

（1浙江金象科技有限公司浙江東陽(yáng)3221002浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院浙江杭州310015）

全氟辛烷磺酸（PFOA）對(duì)斜生柵藻的毒性效應(yīng)研究

蔣美卿1許曉路2*張德勇2

（1浙江金象科技有限公司浙江東陽(yáng)3221002浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院浙江杭州310015）

為了分析全氟辛烷磺酸（PFOA）對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)的危害，選擇斜生柵藻為受試對(duì)象。首先設(shè)計(jì)了急性毒性試驗(yàn)，計(jì)算出PFOA對(duì)斜生柵藻的96h-EC50值為139.23 mg/L。然后將斜生柵藻在含有不同濃度PFOA的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)8天，測(cè)定葉綠素、抗氧化酶、丙二醛等指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，斜生柵藻的葉綠素含量在PFOA達(dá)到50mg/L劑量時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)出降低，抗氧化酶類(lèi)的活性在PFOA達(dá)到50mg/L或100mg/L劑量時(shí)表現(xiàn)出降低，MDA含量在PFOA達(dá)到150mg/L劑量時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)為上升。研究結(jié)果顯示PFOA在高濃度下會(huì)影響藻類(lèi)的光合作用及多種代謝活動(dòng)。

PFOA；斜生柵藻；葉綠素；抗氧化酶；丙二醛

全氟辛烷磺酸（PFOA）分子式為C8F17SO3，它由全氟化酸性硫酸基酸中完全氟化的陰離子組成。PFOA是一種持久性有機(jī)污染物，具有難以降解、易于經(jīng)食物鏈在各級(jí)生物體內(nèi)蓄積等特點(diǎn)。PFOA分子中的碳氟鍵高度穩(wěn)定，水解、光解、生物降解等手段均難以對(duì)其發(fā)揮降解作用[1]。半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，PFOA作為表面保護(hù)劑廣泛應(yīng)用于毛毯、皮革、紙張、包裝材料、纖維等產(chǎn)品，或作為表面活性劑應(yīng)用于起泡劑、酸霧抑制劑、堿性清潔劑、地板拋光劑、感光膠片、義齒清潔劑、洗發(fā)水等[2]。目前在全球大多數(shù)水系中均能檢測(cè)到PFOA的污染，其潛在的生態(tài)威脅受到高度關(guān)注。包括歐盟國(guó)家、美國(guó)等在內(nèi)的許多國(guó)家已經(jīng)采取措施限制相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用。

已有的研究顯示，PFOA對(duì)魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)、大鼠等動(dòng)物具有多種毒性，涉及生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、腎臟毒性等，但在藻類(lèi)上的研究報(bào)道尚且不多見(jiàn)，相關(guān)研究尚不夠系統(tǒng)和深入[3]。藻類(lèi)是水生生態(tài)系統(tǒng)中初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和生態(tài)平衡至關(guān)重要。有些藻類(lèi)甚至被作為水質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)，因?yàn)樗鼈兺趦艋w富營(yíng)養(yǎng)化中起到重要作用，對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)敏感[4]。斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是一種常見(jiàn)的淡水綠藻，易于在營(yíng)養(yǎng)豐富的水體中繁殖，是一種常用的水質(zhì)評(píng)價(jià)指示生物。由于斜生柵藻易于人工培養(yǎng)，也經(jīng)常用于生態(tài)毒理學(xué)研究領(lǐng)域。本研究主要擬研究水中的PFOA對(duì)斜生柵藻的繁殖及一些關(guān)鍵的生化指標(biāo)有何影響，以初步揭示其對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的潛在毒性。

1　材料與方法

1.1材料

斜生柵藻由中科院水生生物研究所提供；PFOA購(gòu)自百靈威公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑由浙江樹(shù)人大學(xué)生態(tài)與環(huán)境保護(hù)研究所提供。

1.2藻類(lèi)培養(yǎng)與染毒方案

斜生柵藻接種于含不同濃度PFOA的HB-4培養(yǎng)基，于250mL的錐形瓶進(jìn)行培養(yǎng)，起始濃度為7×105個(gè)/mL[5]。急性毒性實(shí)驗(yàn)中PFOA濃度為80mg/L～600 mg/L，慢性毒性實(shí)驗(yàn)中為20 to 250 mg/L。藻類(lèi)培養(yǎng)過(guò)程中用4層紗布封口，于24℃、光照黑暗循環(huán)(12h/12h)條件培養(yǎng)8天，每天搖動(dòng)5次。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。每天取樣分析增殖速度，實(shí)驗(yàn)結(jié)束（8天）后測(cè)定葉綠素含量、抗氧化酶系、MDA等。

1.396h-EC50計(jì)算

藻類(lèi)的生物量用光密度法進(jìn)行快速測(cè)定，基于前期研究中建立的公式“y=0.0134x+0.036”進(jìn)行藻類(lèi)細(xì)胞密度換算。式中y為A690值，x為細(xì)胞數(shù)量（*106個(gè)/mL）。分別計(jì)算出不同濃度PFOA染毒96h后，對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的抑制率，利用Jiang等報(bào)道的方法，計(jì)算96h-EC50值[6]。

1.4葉綠素含量分析

取30mL藻液用0.45μm濾膜過(guò)濾截留藻細(xì)胞，將其帶濾膜剪碎移入研缽，加入少量乙醇研磨，離心后濾液定容到10 mL，于4℃黑暗環(huán)境中提取4 h。提取液3000rpm離心20 min，取上清，移入10mL比色管。用90%乙醇定容至10 mL。取上清液于比色皿中，以90%乙醇溶液作參比，于分光光度計(jì)上提取液的A665和A649值。葉綠素a濃度（mg/L）=13.95A665-6.88A649；葉綠素b濃度（mg/L）=24.96A649-7.32A665。二者之和為葉綠素濃度。

1.5抗氧化酶系的活力分析

取30mL藻液，4000g離心15 min，沉淀用pH7.8的PBS重懸，進(jìn)行超聲破碎。10000g離心10 min，上清作為粗酶液，分別測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）的活力。CAT的測(cè)定，反應(yīng)體系中加6 mL0.05 mol/LPBS(pH7.0)、0.4 mL 0.3%H2O2，、0.1 mL粗酶液。每分鐘使A240值升高0.01的酶活力定義為1個(gè)CAT酶活單位[7]。SOD活性分析采用Chen等報(bào)道的方法，能抑制該反應(yīng)體系每分鐘ΔA560值達(dá)50%抑制率的酶活力定義為1個(gè)酶活單位[7]。POD活力的測(cè)定參照Bewley等報(bào)道的方法，使該反應(yīng)體系每分鐘A470變化值達(dá)0.01的酶活力定義為1個(gè)單位[8]。單位質(zhì)量藻樣中的酶活力=總酶活/樣品總重。

1.6丙二醛（MDA）含量分析

30mL藻液經(jīng)濾膜濃縮后，加入10%TCA，直接研磨破碎藻細(xì)胞，勻漿經(jīng)10000g離心10min，上清液為丙二醛提取液。吸取2 mL提取液于試管中，加入0.6%硫代巴比妥酸2 mL，于沸水浴上加熱10min，迅速冷卻。于4000 g離心10min，取上清，測(cè)A450、A532、A600值。MDA的濃度=6.45（A532-A600）-0.56*A450[9]。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件(V11.5)，采用One-wayANOVA方法分析不同實(shí)驗(yàn)組結(jié)果之間的差異顯著性。

2　結(jié)果

2.196h-EC50值

抑制率(P%)和濃度的自然對(duì)數(shù)(LnC)的線(xiàn)性回歸方程：y=0. 2968x-0.9164，R2=0.9964。經(jīng)計(jì)算，PFOA對(duì)斜生柵藻的96h-EC50值為139.23 mg/L。

2.2葉綠素及MDA含量

表1所示，當(dāng)PFOA劑量大于或等于50 mg/L時(shí)，引起斜生柵藻中葉綠素a的含量降低（p＜0.05）；當(dāng)PFOA劑量大于或等于100 mg/L時(shí)，引起斜生柵藻中葉綠素b的含量及總?cè)~綠素含量降低（p＜0.05）；當(dāng)PFOA劑量大于或等于150 mg/L時(shí)，引起斜生柵藻中MDA含量升高（p＜0.05）。這些結(jié)果顯示PFOA會(huì)影響斜生柵藻中的葉綠素含量與MDA含量。

表1　各處理組的葉綠素含量及MDA含量

2.3抗氧化酶的活性

如表2所示，當(dāng)PFOA劑量大于或等于50 mg/L時(shí)，引起斜生柵藻中SOD活力降低（p＜0.05）；當(dāng)PFOA劑量大于或等于100 mg/L時(shí)，引起斜生柵藻中CAT活力與POD活力降低（p＜0.05）。

表2　各處理組的三種抗氧化酶類(lèi)的活性

3　討論

在世界各地的水系中普遍檢測(cè)到PFOA污染，而關(guān)于其對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的危害研究報(bào)道尚較少。本研究PFOA對(duì)斜生柵藻具有毒性效應(yīng)，能抑制藻類(lèi)的增殖，并就算出其96h-EC50值139.23 mg/L。八天的染毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，這種PFOA暴露會(huì)引起斜生柵藻的葉綠素含量下降、MDA含量上升及抗氧化酶類(lèi)的活性降低。這種效應(yīng)大多于PFOA劑量達(dá)到50mg/L時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)出來(lái)。當(dāng)PFOA劑量達(dá)到250 mg/L時(shí)，葉綠素a含量降低了約77%，葉綠素b含量降低了約45%，MDA濃度升高了約53%，CAT活力降低了約80%，POD活力降低了約74%，SOD活力降低了約77%，反映了高濃度的PFOA對(duì)藻類(lèi)的生理活動(dòng)影響非常明顯。

本研究主要分析了藻類(lèi)的葉綠素、抗氧化酶類(lèi)活性、MDA含量幾個(gè)重要的指標(biāo)。葉綠素是藻類(lèi)進(jìn)行光合作用的基本依賴(lài)條件，其含量多少直接反映了藻類(lèi)代謝和增殖活力的強(qiáng)弱。本研究中當(dāng)PFOA劑量達(dá)到100 mg/L時(shí)，不管葉綠素a還是葉綠素b均開(kāi)始表現(xiàn)出含量下降（p＜0.05），反映了PFOA對(duì)藻類(lèi)的光合作用有影響，且與劑量有關(guān)?？寡趸割?lèi)通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧可以幫助藻類(lèi)保持氧代謝平衡，保護(hù)細(xì)胞膜免受膜脂過(guò)氧化損傷，從而維持細(xì)胞的完好性。在本研究中，低劑量的PFOA（低于50 mg/L）雖然引起了抗氧化酶類(lèi)的活性平均水平稍低，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，這種抑制作用從PFOA劑量達(dá)到50 mg/L時(shí)開(kāi)始逐步顯現(xiàn)，并與劑量表現(xiàn)出正相關(guān)。MDA含量是細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可反映植物遭受逆境傷害的程度，作為一種抗逆性分子，它在植物處于脅迫環(huán)境中時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生，本研究中MDA濃度在PFOA劑量達(dá)到150mg/L時(shí)開(kāi)始顯著升高（p＜0. 05），顯示在高濃度PFOA環(huán)境中，藻類(lèi)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的膜脂過(guò)氧化，也就意味著細(xì)胞的損傷。

4　結(jié)語(yǔ)

本研究證實(shí)了高濃度的PFOA對(duì)水體中的藻類(lèi)有多方面的毒性作用，會(huì)對(duì)藻類(lèi)的光合作用、抗氧化酶類(lèi)的活力、膜脂完好性等有損害，說(shuō)明PFOA大量排放會(huì)對(duì)淡水生態(tài)環(huán)境造成威脅，應(yīng)引起重視。

[1]Giesy,J.P.&Kannan,K.2002.Perfluorochemical surfactants in the environment.Environ Sci Technol,Vol.36,p.146A-152A.

[2]Giesy,J.P.&Kannan,K..2001.Global distribution of perfluorooctane sulfonate in wildlife.Environ Sci Technol,Vol.35,p.1339-1342.

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蔣美卿（1974—)，女，浙江東陽(yáng)人，本科，工程師，主要從事工程設(shè)計(jì)、環(huán)境保護(hù)等方面的研究。