姜翠鳳，吳銀杏，翟雪松，宋 娟

(鹽城工學(xué)院材料工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

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分析測(cè)試

基于金銀復(fù)合納米粒子的三聚氰胺檢測(cè)*

姜翠鳳，吳銀杏，翟雪松，宋 娟

(鹽城工學(xué)院材料工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

為實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的快速簡(jiǎn)便檢測(cè)，我們提出一種基于金銀復(fù)合納米粒子，利用紫外吸收光譜檢測(cè)三聚氰胺的方法。首先，以金納米粒子為晶種制備金銀復(fù)合納米材料。然后，基于三聚氰胺誘導(dǎo)復(fù)合粒子聚集而使其紫外吸收光譜發(fā)生變化的原理，構(gòu)建以金銀復(fù)合納米粒子為基底的三聚氰胺傳感器，具有較好的準(zhǔn)確度和選擇性。該方法樣品制備無需修飾，且成本大大降低；檢測(cè)過程簡(jiǎn)便快速，10 min即可完成檢測(cè)，有望應(yīng)用于三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。

金銀；復(fù)合納米粒子；三聚氰胺；快速；檢測(cè)

三聚氰胺(Melamine)，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，簡(jiǎn)稱三胺。因其含氮量為66%，是牛奶含氮量的4倍，一些不法商家經(jīng)常將三聚氰胺添加到食品中冒充蛋白質(zhì)[1]。然而，三聚氰胺不能被人體代謝，長(zhǎng)期攝入會(huì)對(duì)人體健康造成不利影響，嚴(yán)重的甚至能引起死亡[2]。2008年9月，中國(guó)發(fā)生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導(dǎo)致嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥的嚴(yán)重事件，一時(shí)間引起人們對(duì)三聚氰胺的高度關(guān)注。準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測(cè)三聚氰胺成為國(guó)家和廣大科研工作者關(guān)注的課題。目前，檢測(cè)三聚氰胺的方法主要有：液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜以及酶聯(lián)免疫吸附分析法等[1,3-5]。這些方法雖然各有優(yōu)點(diǎn)，但是需要精密的大型儀器、復(fù)雜的樣品前處理和專業(yè)操作人員，不能滿足便利、實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)三聚氰胺的需求。比色法的出現(xiàn)為三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)提供了新思路。例如，鐘堅(jiān)海等[6]利用三聚氰胺可以使金納米顆粒聚集變色的特性，向納米金溶液中加入適量的三聚氰胺，即可由納米金溶液顏色由紅色變?yōu)樽仙?，從而?shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)三聚氰胺。又如公開號(hào)為CN101846631A的中國(guó)專利通過金納米粒子的制備、冠醚的衍生化、金納米粒子偶聯(lián)冠醚、運(yùn)用金納米粒子自組裝和分子識(shí)別檢測(cè)三聚氰胺[7]。根據(jù)金納米粒子體系的顏色變化，可檢測(cè)奶粉中的三聚氰胺含量。然而，目前報(bào)道的比色(紫外可見吸收)法檢測(cè)三聚氰胺多用金納米粒子做探針。要實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的批量化和市場(chǎng)化，成本較高。因此，開發(fā)免修飾、低成本的納米探針用于比色法檢測(cè)三聚氰胺成為三聚氰胺檢測(cè)中面臨的關(guān)鍵問題。

本文提出一種利用金銀復(fù)合納米材料做探針，通過紫外可見吸收光譜檢測(cè)三聚氰胺的方法。首先在水相環(huán)境中，以金納米粒子為晶種原位制備金銀復(fù)合納米粒子，通過控制抗壞血酸的加入速度獲得尺寸均勻的納米粒子。然后，基于三聚氰胺誘導(dǎo)金銀復(fù)合納米粒子聚集而使其紫外可見吸收光譜發(fā)生變化的原理，構(gòu)建以金銀復(fù)合納米粒子為基底的三聚氰胺傳感器，具有較好的靈敏度和選擇性。該方法樣品制備無需修飾，且只有晶種用到金納米粒子，成本大大降低；檢測(cè)過程簡(jiǎn)便快速，10 min 即可完成檢測(cè)；靈敏度和選擇性較好，有望應(yīng)用于三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 金銀復(fù)合納米粒子的制備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

硼氫化鈉(NaBH4)，安耐吉化學(xué)；L-抗壞血酸，Alfa Aesar；氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸鈉、硝酸銀，Sigma Aldrich；三聚氰胺、谷胱甘肽、葡萄糖、果糖、麥芽糖、胸腺嘧啶、KCl、CaCl2，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

所有玻璃儀器均用王水(濃HNO3:濃HCl=1:3)洗滌。除特別說明，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.1.2 金銀復(fù)合納米粒子的制備方法

金納米粒子的制備：將1.47 mg檸檬酸鈉和1.97 mg HAuCl4·3H2O溶解在20 mL水中，劇烈攪拌，向其中加入0.2 mL 0.1 M的新鮮NaBH4溶液(用冰水配制)，2 s后，溶液變成棕紅色，表明金納米粒子生成，繼續(xù)攪拌5 min，備用。

金銀復(fù)合納米粒子的制備：向溶解有10 mg AgNO3和30 mg 檸檬酸鈉的50 mL水溶液中迅速加入3 mL金納米粒子溶液。然后將30 mg(10 mL)抗壞血酸，逐滴加入到上述溶液中，約10 min加完。黑暗處繼續(xù)攪拌1 h, 得到棕黃色的金銀復(fù)合納米粒子溶液。

1.2 樣品的性能及表征

將納米粒子溶液滴到銅網(wǎng)上(2滴)，然后用場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN進(jìn)行觀測(cè)獲得透射電鏡照片。UV-Visible紫外可見吸收光譜由Shimadzu公司UV-2450紫外可見分光光譜儀測(cè)得。

1.3 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

取0.2 mL所制備的復(fù)合納米粒子溶液，加入不同濃度的三聚氰胺，混合均勻后，靜置10 min，加一定量的去離子水稀釋，進(jìn)行紫外可見分光光譜表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子形貌表征

傳統(tǒng)方法制備金銀復(fù)合納米粒子存在尺寸不均的問題，本文以金納米粒子為晶種，原位制備金銀復(fù)合納米材料，通過控制抗壞血酸的加入速度，得到尺寸均勻的復(fù)合納米粒子。對(duì)所制備的納米粒子進(jìn)行透射電鏡表征，照片如圖1所示。從圖1中可見，金納米種子的尺寸約為 4 nm，而復(fù)合粒子為球形，尺寸約為 13 nm，復(fù)合粒子大小均勻，分散性好，從透射電鏡中不能辨別是否核殼結(jié)構(gòu)?？箟难岷拖跛徙y加入后，在檸檬酸鈉做表面保護(hù)劑的情況下，金納米粒子做晶種，在其表面上，抗壞血酸還原硝酸銀得到納米銀，隨著抗壞血酸的繼續(xù)加入，納米銀不斷長(zhǎng)大，直到形成最后的復(fù)合納米粒子[8]。

圖1 所制備的金納米種子(a)、金銀復(fù)合

2.2 紫外-可見吸收光譜分析

為了研究復(fù)合粒子隨時(shí)間的成長(zhǎng)過程，對(duì)所制備的金納米粒子和金銀復(fù)合納米粒子溶液進(jìn)行紫外可見分光光譜表征，如圖 2所示。從圖2可見，所得金納米種子溶液為酒紅色，在520 nm處有一吸收峰。而金銀復(fù)合納米粒子呈深黃色，紫外吸收峰在400 nm，與純銀納米粒子的吸收峰值相似[9]。為了研究復(fù)合粒子的生長(zhǎng)過程，我們對(duì)其吸收光譜隨反應(yīng)時(shí)間的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖3所示。從圖3可見，檸檬酸鈉、硝酸銀、金種子溶液、抗壞血酸加入的瞬間，金納米種子在520 nm的特征吸收峰消失，而400 nm出現(xiàn)新的吸收峰，表明金銀復(fù)合納米粒子的形成。這是因?yàn)榭箟难崾菑?qiáng)還原劑，短時(shí)間內(nèi)迅速將銀離子還原為納米銀。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，400 nm的吸收峰值越來越高，在反應(yīng)60 min后達(dá)到最大值并不再變化，表明反應(yīng)已經(jīng)完全結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸加入的速度與復(fù)合納米粒子的均勻性有著密切關(guān)系，10 min左右逐滴加入抗壞血酸，所得納米粒子尺寸均勻。反之，若抗壞血酸一次性急速加入，則納米粒子尺寸不一。

圖2 金納米種子溶液(a)和Au/Ag復(fù)合納米粒子(b)的圖片及

圖3 復(fù)合納米粒子吸收光譜隨反應(yīng)時(shí)間的變化

2.3 三聚氰胺檢測(cè)線性范圍與檢測(cè)限

三聚氰胺是一種工業(yè)粘合劑，由于其富含氮而經(jīng)常被添加到食品中。食品中三聚氰胺的添加會(huì)造成腎臟和泌尿系統(tǒng)的疾病，實(shí)驗(yàn)證明長(zhǎng)期攝取三聚氰胺可造成人體多臟器官損害[6]。所以三聚氰胺的檢測(cè)成為分析檢測(cè)領(lǐng)域一個(gè)非常重要的課題。

貴金屬納米粒子存在等離子體共振現(xiàn)象，具有局部表面等離子體共振吸收峰。研究表明，納米粒子的形狀和聚集狀態(tài)對(duì)等離子體共振峰的位置有著顯著的影響[10-11]?；诖?，貴金屬納米材料被用于化學(xué)與生物分子的檢測(cè)[12-13]。本文正是利用這一原理設(shè)計(jì)了檢測(cè)三聚氰胺的傳感體系。將三聚氰胺加入復(fù)合粒子溶液中后，溶液顏色發(fā)生了顯著改變，從原來的淡黃色變?yōu)樯铧S色，隨著三聚氰胺濃度的增大，顏色變?yōu)楹邳S色(圖4所示)。通過TEM照片可以非常清晰的觀察納米粒子的形態(tài)，加入三聚氰胺后，復(fù)合粒子發(fā)生了聚集(圖1c)。如圖4所示，單純的復(fù)合納米粒子分布均勻，加入三聚氰胺后，復(fù)合粒子開始聚集，且聚集程度很高，說明三聚氰胺導(dǎo)致了復(fù)合粒子的聚集。這是因?yàn)槿矍璋贩肿又腥齻€(gè)胺基的氮原子可與復(fù)合粒子表面結(jié)合，而三聚氰胺分子之間又可以形成氫鍵，通過相鄰的復(fù)合粒子上三聚氰胺分子之間的氫鍵作用而使復(fù)合粒子發(fā)生聚集[14]。通過紫外可見吸收光譜對(duì)三聚氰胺濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隨著三聚氰胺的加入，復(fù)合粒子在400 nm的吸收峰降低，并且隨著三聚氰胺濃度的增大，逐漸降低，而在636 nm出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。400 nm的吸收值代表單分散的納米粒子，而636 nm的吸收值代表聚集的納米粒子，因此，A636/A400代表聚集的納米粒子與單分散的納米粒子數(shù)目之比。用A636/A400對(duì)三聚氰胺的濃度作曲線，呈線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為0.025 mM，檢測(cè)范圍從0.083 mM到2.04 mM。

圖4 復(fù)合納米粒子紫外可見吸收光譜隨三聚氰胺濃度的

圖5 A636/A400對(duì)三聚氰胺濃度的曲線圖

2.4 選擇性

為考察體系對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的特異性，分別加入1.6 mM的干擾物質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、麥芽糖、果糖、K+、抗壞血酸、胸腺嘧啶等生物體內(nèi)常見成分的A636/A400均很小，谷胱甘肽和Ca2+的A636/A400略大，但與三聚氰胺的A636/A400相比，相對(duì)較小，表明用此復(fù)合粒子檢測(cè)三聚氰胺具有較好的選擇性。

圖6 金銀復(fù)合納米粒子用于三聚氰胺檢測(cè)的選擇性

2.5 回收率測(cè)定

為了進(jìn)一步證明金銀復(fù)合納米粒子可以用來檢測(cè)三聚氰胺，選取0.8 mM和1.5 mM兩個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行了自來水和去離子水樣品的加入回收試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，無論在自來水還是去離子水中，用金銀納米復(fù)合粒子對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)都具有較好回收率，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都較小，說明所設(shè)計(jì)的方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表1 自來水和去離子水中三聚氰胺的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文以金銀復(fù)合納米粒子為探針，利用紫外可見吸收光譜法實(shí)現(xiàn)了三聚氰胺的快速、低成本檢測(cè)。首先在水相環(huán)境中，以金納米粒子為晶種原位制備了尺寸均勻的金銀復(fù)合納米粒子，尺寸約為13 nm。然后，基于三聚氰胺引起復(fù)合納米粒子聚集而使其紫外可見吸收光譜發(fā)生變化的原理,對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限為0.025 mM，檢測(cè)范圍從0.083 mM到2.04 mM，且具有較好的選擇性。在自來水和去離子水樣品中進(jìn)行的加入回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。總之，該方法所需復(fù)合粒子探針制備簡(jiǎn)單，無需修飾，成本較低；檢測(cè)過程快速，且具有較高的準(zhǔn)確度，在三聚氰胺的實(shí)時(shí)快速以及產(chǎn)業(yè)化檢測(cè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。

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Detection of Melamine Based on Au/Ag Nanocomposite*

JIANGCui-feng,WUYin-xing,ZHAIXue-song,SONGJuan

(School of Materials Engineering, Yancheng Institute of Technology, Jiangsu Yancheng 224051, China)

To achieve rapid and simple detection of melamine, a method based on Au/Ag nanocomposite by using UV-Visible spectra was proposed.Firstly, Au/Ag nanocomposite was prepared by using Au nanoparticles as seed.Then, a sensing platform for melamine was fabricated based on the principle that melamine induced aggregation of Au/Ag nanocomposite, leading to change of UV-Vis spectra.The assay displayed good accuracy and selectivity.The proposed method is label-free and low cost due to use of Au/Ag nanocomposite instead of Au nanoparticles.The whole detect process is simple and fast, which can be finished in 10 min.Thus, the method could be used in real-time and rapid detection of melamine.

Au/Ag; nanocomposite; melamine; rapid; detection

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21605128)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20150427)。

姜翠鳳(1982-)，女，副教授，研究方向：貴金屬納米材料的制備及應(yīng)用。

TB331

A

1001-9677(2016)019-0132-04